魏 超，張 曉*，高 杰

(東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是一種惡性消化系統(tǒng)腫瘤，全球每年因患胰腺癌而死亡的患者超過200萬例[1-2]，在我國胰腺癌的發(fā)病率也位居惡性腫瘤中的第10位，死亡率高居第6位，且每年均呈上升趨勢[3]，其發(fā)病隱匿、早期診斷困難、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差[4]。因此尋找更有效的臨床指標(biāo)對胰腺癌患者的診斷和治療顯得非常重要。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指一組核苷酸數(shù)量大于200的RNA，缺乏蛋白質(zhì)編碼潛力[5]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可以通過促進(jìn)或抑制癌癥的發(fā)展進(jìn)而在診斷和治療腫瘤的過程中發(fā)揮作用[6-11]。

近年來，生物信息學(xué)的快速發(fā)展為診斷和挖掘疾病治療靶點提供了一個新的方向。因此，本文試圖通過使用生物信息學(xué)方法，從基因芯片表達(dá)匯編(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫和癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中下載獲得胰腺癌基因相關(guān)數(shù)據(jù)，對其進(jìn)行分析整合，從而為診斷和治療胰腺癌提供新的治療靶點和分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)材料

本研究在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫中檢索胰腺癌芯片數(shù)據(jù)。選用樣本量較多的GSE15471、GSE16515、GSE71989數(shù)據(jù)集下載并進(jìn)行后續(xù)分析。其中GSE15471包括39例胰腺癌和39例癌旁正常標(biāo)本，GSE16515包括37例胰腺癌和36例癌旁正常標(biāo)本，GSE71989包括13例胰腺癌和8例癌旁正常標(biāo)本。

1.2 篩選差異表達(dá)基因和lncRNA

通過Gencode數(shù)據(jù)庫V15(http://www.gencodegenes.org/releases/current.htm l)進(jìn)行l(wèi)ncRNA注釋，利用blast程序，通過U133PLUS 2.0技術(shù)將lncRNA數(shù)據(jù)庫與mRNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，獲得lncRNA；運用GEO數(shù)據(jù)庫中自帶的GEO 2R在線分析軟件分析GSE15471、GSE16515、GSE71989中胰腺癌與正常組織的差異表達(dá)基因和 lncRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|＞2且 P＜0.05。選取在3個數(shù)據(jù)芯片中的交集mRNA和lncRNA。

1.3 差異表達(dá)基因功能及通路富集分析

利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對差異基因進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)生物學(xué)過程富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，富集標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

1.4 差異表達(dá)基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于KEGG中Pathway的基因調(diào)控關(guān)系，解構(gòu)數(shù)據(jù)庫，在全KEGG-Pathway數(shù)據(jù)庫的范圍內(nèi)篩選某個蛋白的上游或下游蛋白，從而得到數(shù)據(jù)庫中任何一個基因的表達(dá)產(chǎn)物和其他基因表達(dá)產(chǎn)物的相互作用關(guān)系，并通過Cytoscape 2.8.2進(jìn)行圖標(biāo)繪制。

1.5 lncRNA-mRNA-net共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

取3個數(shù)據(jù)集GSE15471、GSE16515、GSE71989中共表達(dá)關(guān)系的交集，即將在3個數(shù)據(jù)集中均存在的lncRNA-mRNA共表達(dá)關(guān)系對納入網(wǎng)絡(luò)。通過計算lncRNA與mRNA的皮爾森相關(guān)系數(shù)r，選取相關(guān)系數(shù)的絕對值(|r|)≥0.85，且P＜0.05的lncRNA-mRNA對，構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并通過網(wǎng)絡(luò)作圖軟件Cytoscape 2.8.2繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 lncRNA-mRNA-pathway網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在KEGG數(shù)據(jù)庫中將lncRNA與它對應(yīng)的mRNA，以及參與重要通路的基因和通路名稱的關(guān)系對，導(dǎo)入Cytoscape 2.8.2軟件中進(jìn)行可視化，構(gòu)建信號通路的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

1.7 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建

對尋找到的lncRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的編碼蛋白基因，通過STRING軟件(https://string-db.org/)尋找基因?qū)?yīng)蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。設(shè)置最小相互調(diào)控作用預(yù)測得分(minimum required interaction score)＞0.4，得到基因產(chǎn)物蛋白之間的調(diào)控關(guān)系，然后構(gòu)建蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.8 生存分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫中(https://tcga-data.nci.nih.gov/)提取177例胰腺癌患者生存數(shù)據(jù)，使用R語言“Survival”軟件包，對篩選出的差異mRNA、lncRNA和胰腺癌患者生存時間進(jìn)行相關(guān)性分析，檢驗方法為Log-rank χ2檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選

根據(jù)圖1可以發(fā)現(xiàn)，根據(jù)篩選條件，在芯片GSE15471中得到差異mRNA 3 864個，其中上調(diào)基因1 509個，下調(diào)基因2 345個；差異lncRNA 1 873個，其中上調(diào)基因197個，下調(diào)基因1 676個。在芯片GSE16515中得到差異mRNA 3 019個，其中上調(diào)基因1 020個，下調(diào)基因1 999個；差異lncRNA 1 330個，其中上調(diào)基因98個，下調(diào)基因1 232個。在芯片GSE71989中得到差異mRNA 3 631個，其中上調(diào)基因1 479個，下調(diào)基因2 152個；差異lncRNA 1 625個，其中上調(diào)基因208個，下調(diào)基因1 417個。對3個芯片篩選出的差異mRNA、lncRNA取交集并通過韋恩圖(圖2)展現(xiàn)，得到與胰腺癌相關(guān)可信度高的差異mRNA 1 147個、lncRNA 336個。

圖1 胰腺癌中差異lncRNA和m RNA的熱圖

圖2 胰腺癌中異常表達(dá)的差異lncRNA和mRNA的韋恩圖

2.2 差異表達(dá)基因功能及通路富集分析

通過DAVID對上述得到的1 147個差異mRNA基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的差異mRNA基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、膠原分解等過程，下調(diào)的差異mRNA基因主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、蛋白水解、細(xì)胞鋅離子穩(wěn)態(tài)等過程。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)差異mRNA基因主要涉及腫瘤通路、人類乳頭瘤病毒感染、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、蛋白質(zhì)消化吸收等通路，下調(diào)差異mRNA基因涉及鈣信號通路、代謝通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、胰液分泌等通路。排名前20位的差異mRNA基因顯著性功能和通路如圖3所示。

圖3 差異表達(dá)基因GO分析和KEGG分析結(jié)果

2.3 差異表達(dá)基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分析

差異表達(dá)基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)中共有62個上調(diào)mRNA和79個下調(diào)mRNA，上調(diào)mRNA中調(diào)控數(shù)量前3位的是 GNA15(13 個)、SMAD3(9 個)、ITGA2(9 個)、STAT1(7個)、SDC1(7個)、CXCR4(7個)，下調(diào)mRNA中調(diào)控數(shù)量前3位的是GNAS(13個)、PLCB1(11個)、CALML5(10個)，見圖4。

2.4 lncRNA-m RNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

通過lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)有7個lncRNA與61個mRNA具有高度的共表達(dá)關(guān)系。NONHSAT166626.1、ENST00000536141.1與NONHSAT 138174.2居于lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的核心位置，與眾多mRNA均具有共表達(dá)關(guān)系。見圖5。

2.5 lncRNA-m RNA-pathway調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包括3個上調(diào)lncRNA和11個下調(diào)lncRNA，13個上調(diào)mRNA和16個下調(diào)mRNA及46條通路，其中調(diào)控數(shù)量前3位的lncRNA是NONHSAT166626.1(10個)、ENST00000536141.1(7個)、NONHSAT138174.2(6個)，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的mRNA前5位分別是 HLA-F(12個)、HLA-G(12個)、FN1(11個)、COL1A1(10個)、COL1A2(10個)，排名前3位的通路是蛋白質(zhì)消化吸收(8個)、人類乳頭瘤病毒感染(6個)、代謝途徑(5個)。見圖6。

2.6 差異m RNA及其蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

在差異mRNA間的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中COL1A1、COL3A1、COL5A2居于重要節(jié)點，具體見圖7。

2.7 生存分析

對TCGA數(shù)據(jù)集中胰腺癌的生存分析發(fā)現(xiàn)，12個lncRNA與胰腺癌的生存預(yù)后密切相關(guān)。它們的生存曲線見圖8，其中基因ATP1A1-AS1、CBR3-AS1、CTD-3080P12.3、 FAM66D、 FAM87A、 FLJ38576、 LINC 00476、LINC00574、LINC01554、PYY2高表達(dá)的胰腺癌患者生存時間延長，而基因LINC00857、OVOL1-AS1的高表達(dá)會使胰腺癌患者的生存時間縮短(P＜0.05)。

圖4 差異表達(dá)基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)

圖5 lncRNA-m RNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

3 討論

胰腺癌是一種惡性程度較高的消化系統(tǒng)腫瘤，其病死率位居惡性腫瘤死亡的第4位。目前手術(shù)治療仍是胰腺癌常規(guī)治療手段，胰腺癌手術(shù)患者如能早期診斷并進(jìn)行手術(shù)治療，其5年生存率可達(dá)24%[12]。但由于其起病隱匿、侵襲性強(qiáng)、進(jìn)展迅速且預(yù)后較差，所以目前胰腺癌治愈性切除率僅為5%[13]，其5年整體生存率低于6%[14-15]。而近年來隨著分子醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，生物信息學(xué)為診斷疾病和挖掘疾病治療靶點提供了一項新的技術(shù)手段[16]。

圖6 lncRNA-m RNA-pathway調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖7差異m RNA及其蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

因此，本文運用生物信息學(xué)技術(shù)，通過對GEO數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出胰腺癌相關(guān)可信度高的差異mRNA 1 147個、lncRNA 336個，對mRNA進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)的差異基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、膠原分解等過程，下調(diào)的差異基因主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、蛋白水解、細(xì)胞鋅離子穩(wěn)態(tài)等過程。信號通路分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)差異基因主要涉及癌癥通路、人類乳頭瘤病毒感染、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、蛋白質(zhì)消化吸收等通路，下調(diào)差異基因涉及鈣信號通路、代謝通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、胰液分泌等通路。之后通過構(gòu)建信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)表明差異基因?qū)σ认侔┑陌l(fā)生發(fā)展有重要影響。并通過lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)找到7個與mRNA具有高度的共表達(dá)關(guān)系lncRNA，通過lncRNA-mRNA-pathway網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)了14個對mRNA及通路具有重要調(diào)控價值的lncRNA。最后通過與TCGA數(shù)據(jù)庫信息結(jié)合進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)有12個lncRNA與胰腺癌的預(yù)后相關(guān)，分別是 ATP1A1-AS1、CBR3-AS1、CTD-3080P12.3、 FAM66D、 FAM87A、 FLJ38576、 LINC 00476、 LINC00574、 LINC01554、 PYY2、 LINC 00857、OVOL1-AS1。

圖8 lncRNA生存分析結(jié)果

以往的研究發(fā)現(xiàn)這些lncRNA對其他疾病也有著顯著的影響。ATP1A1-AS1基因作為Na/K-ATPaseα1的中度負(fù)調(diào)控因子，可以調(diào)節(jié)人腎細(xì)胞中Na/KATPase相關(guān)信號通路[17]；研究發(fā)現(xiàn)CBR3-AS1對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡具有致癌作用，是骨肉瘤患者獨立的不良預(yù)后影響因素[18]；FAM66D在促性腺激素腺瘤的分子調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[19]；LINC00476可以在某種程度上揭示尼古丁依賴治療靶點的生物學(xué)機(jī)制和發(fā)展[20]；LINC00574和LINC01554分別對乳腺癌、食管癌的預(yù)后有著顯著影響[21-22]；PYY2主要是在睪丸和前列腺中差異表達(dá)[23]；LINC 00857通過細(xì)胞周期調(diào)控介導(dǎo)腫瘤進(jìn)展，進(jìn)而影響肺腺癌的診斷和預(yù)后[24]。除此以外，本研究還發(fā)現(xiàn)了其他幾個影響胰腺癌預(yù)后的lncRNA，但這些lncRNA對疾病的作用及其機(jī)制大多不明，還需要更加深入的研究加以證實。

之前有學(xué)者對芯片GSE15471、GSE16515、GSE 71989進(jìn)行研究[25-27]，但以往基于芯片的研究大多局限于通過對胰腺癌的mRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過生存分析篩選顯著的mRNA；而針對lncRNA對胰腺癌影響的研究更多是集中在分析單個lncRNA對于胰腺癌的影響[28-30]。而本文利用GEO數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫篩選出了相關(guān)可信度高的差異mRNA 1 147個、lncRNA 336個，不僅比較系統(tǒng)的分析了mRNA和lncRNA對胰腺癌的影響，更通過構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析了lncRNA與mRNA的相互作用關(guān)系，找到7個與mRNA具有高度共表達(dá)關(guān)系的lncRNA，展現(xiàn)了lncRNA的功能和調(diào)控機(jī)制[31-32]，通過lncRNA-mRNA-pathway網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)了14個lncRNA，確定了3個核心lncRNA，揭示了其對mRNA及通路具有重要調(diào)控價值[33]。

綜上所述，本文通過生物信息學(xué)方法研究了lncRNA和mRNA對胰腺癌的發(fā)生發(fā)展所產(chǎn)生的作用，并通過生存分析發(fā)現(xiàn)12個lncRNA和若干個mRNA會對胰腺癌的預(yù)后產(chǎn)生影響。這些lncRNA可能會成為新的胰腺癌治療靶點和分子標(biāo)志物，用以指導(dǎo)胰腺癌的靶向治療和預(yù)后判斷。