廖 鼐，龍 子，海春旭，王 欣*

(空軍軍醫(yī)大學軍事預(yù)防醫(yī)學院毒理學教研室，特殊作業(yè)環(huán)境危害評估與防治教育部重點實驗室，陜西省自由基生物學與醫(yī)學重點實驗室，陜西西安 710032)

近年來，肥胖、糖尿病等糖脂代謝紊亂疾病患病率在全球范圍內(nèi)急劇增加。全球有10億以上的成年人存在超重(定義為體質(zhì)指數(shù)超過25 kg/m2)的問題，超過3億的成年人被歸類為肥胖(體質(zhì)指數(shù)大于30 kg/m2)[1]。經(jīng)估算，在美國有超過35.7%的成年人和16.9%的兒童和青少年被認定為肥胖。2010年，全球糖尿病患病率為6.4%，患病人數(shù)2.85億。到2030年，這些數(shù)字將分別增加到7.7%和4.39億。目前，中國成年人糖尿病患病率為10.9%，糖尿病前期患病率為35.7%[2]。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物暴露與糖尿病、肥胖等糖脂代謝紊亂疾病的全球流行密切相關(guān)[3-4]。持久性有機污染物(persistent organic pollutants，POPs)是一類重要的環(huán)境污染物，這類環(huán)境污染物性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境和人體中都很難降解[5-6]。POPs能長時間滯留于環(huán)境中，在空氣、水等媒介的作用下廣泛傳播，并可通過食物鏈(網(wǎng))累積，呈現(xiàn)生物放大的作用，最終集聚于生物鏈頂部的人身體中。因POPs的高毒性和高親脂性，使其容易沉積于脂肪組織或細胞之中，并且能夠抗生物降解。人體內(nèi)高水平的POPs與糖尿病和代謝紊亂的危險性具有相關(guān)性[7-10]。二噁英是一類重要的POPs，其中 2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)是毒性最強的一種二噁英同類物[11-12]。TCDD可以促進腫瘤生成，引起致畸性、免疫毒性、內(nèi)分泌代謝毒性，嚴重者可以致死。TCDD對內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)的影響是糖脂代謝紊亂疾病流行的重要原因之一。然而，TCDD導致糖脂代謝紊亂的機制還不明確。本研究將采用TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食誘導制作小鼠糖脂代謝紊亂模型，分析TCDD對肝和脂肪組織氧化應(yīng)激和炎癥的影響，為明確TCDD導致糖脂代謝紊亂的分子機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C57BL/6J小鼠由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供；TCDD、D-葡萄糖購自美國Sigma公司；Hoechst、Rho123、dihydroethidium(DHE)探針購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；高脂鼠飼料購自江蘇美迪森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與動物模型 60只小鼠隨機分為4組：對照組、高脂飲食組組、TCDD染毒組、高脂飲食和TCDD染毒聯(lián)合作用組。對照組和TCDD染毒組小鼠給予正常飲食。高脂飲食組和聯(lián)合作用組小鼠給予脂肪熱量為45%的高脂飼料。TCDD染毒組和聯(lián)合作用組小鼠給予含4 mg/L TCDD的飲水。每只小鼠每天的飲水量約為4～5 mL，通過飲水攝入的TCDD劑量約為1 mg/(kg·d)。小鼠染毒時間為3周。染毒結(jié)束后，測定體質(zhì)量，使用羅氏血糖儀和血糖試紙測定空腹和餐后血糖。處理完畢后，小鼠隔夜禁食，苯巴比妥鈉麻醉，眼球摘除取血，頸椎脫臼處死，立即收集肝組織和脂肪組織等樣本，測定肝質(zhì)量和脂肪質(zhì)量，計算肝體比(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)和脂體比(脂肪質(zhì)量/體質(zhì)量)。取部分肝和脂肪組織立即在冰凍條件下切片，部分固定于10%多聚甲醛用于病理觀察，剩余組織儲存于-80°C備用。

1.2.2 糖耐量和胰島素耐量測定 使用腹腔注射葡萄糖耐量試驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)和胰島素耐量試驗(intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT)來評價小鼠對葡萄糖和胰島素的反應(yīng)。染毒最后一天，小鼠禁食12 h，通過鼠尾滴血測定基礎(chǔ)血糖水平。小鼠分別腹腔注射D-葡萄糖(1 g/kg)或諾和靈R胰島素(0.75 U/kg)。分別于注射后30、60、120 min，測定血糖水平。繪制血糖隨時間變化曲線，并計算曲線下面積(area under the curve，AUC)。該面積越大，說明小鼠對葡萄糖或胰島素的反應(yīng)性越差，反之亦然。

1.2.3 ROS水平測定 肝和脂肪組織冰凍切片于暗室用10μmol/L DHE和10μmol/L Hoechst(襯染細胞核)孵育30 min，PBS沖洗3遍，晾干。抗熒光淬滅封片劑封片，共聚焦顯微鏡觀察拍照。每組選取6個樣本，每個樣本選取3個視野，Image J軟件量化分析單位面積的熒光強度。

1.2.4 線粒體膜電位測定 肝組織冰凍切片于暗室中用10μmol/L Rho123和10μmol/L Hoechst(襯染細胞核)孵育30 min，PBS沖洗3遍，晾干。拍照及熒光強度檢測同1.2.3。

1.2.5 實時熒光定量PCR 使用天根總RNA提取試劑盒提取總RNA。使用TaKaRa PrimeScriptTMRTPCR Kit將500 ng RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用1μL cDNA(20μL反應(yīng)體系)進行實時PCR反應(yīng)。反應(yīng)試劑為 SYBR Green PCR kit(Thermo Scientific，IL，USA)，反應(yīng)儀器為CFX96 real-time PCR system。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，變性、退火、延伸循環(huán)30次，最后72℃延伸5 min。RNA相對含量用2-ΔΔCT的方法計算。β-actin為內(nèi)參。引物序列如下：βactin，上游 5'-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3'，下游5'-TGGCGTGAGGGAGAGCATAG-3'；IL-1ɑ，上游5'-CCCGTGTTGCTGAAGGAG-3'，下游5'-ACTTTGT TCTTTGGTGGC-3'；IL-6，上游 5'-TTCCAATGCTCT CCTAAC-3'，下游 5'-TGACCACAGTGAGGAATG-3'；M-MCP1，上游 5'-CATCTGCCCTAAGGTCTT-3'，下游 5'-CATCACAGTCCGAGTCACAC-3'； GPx1，上 游5'-GAAGCGTCTGGGACCTCG-3'，下游5'-CCAGGTC GGACGTACTTG-3'；GCLC，上游 5'-TACGGAGGAA CGATGTCT-3'，下游 5'-CTGTGTTCTGGCAGTGTG-3'；SOD2，上游 5'-CTCAGGTCGCTCTTCAGC-3'，下游 5'-AGCCTCCAGCAACTCTCC-3'；Nrf2，上游 5'-CCACATTCCCAAACAAGA-3'，下游5'-GGGCAGTG AAGACTGAAC-3'。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)均用 xˉ±s表示。采用Graphpad Prism軟件進行統(tǒng)計學分析。采用單因素方差分析多組間差異，如果多組間方差有統(tǒng)計學意義，進一步使用Newman-Keuls方法對4個組進行兩兩組間比較分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝體比和脂體比的影響

本研究首先檢測TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對小鼠體質(zhì)量、肝體比和脂體比等的影響，結(jié)果見圖1。與對照組相比，TCDD染毒、高脂飲食或兩者聯(lián)合作用均使小鼠體質(zhì)量增加，肝體比降低，附睪脂肪質(zhì)量增加，附睪脂體比增加(P均＜0.05)，但未對肝質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。TCDD染毒聯(lián)合高脂飲食組小鼠的體質(zhì)量、肝體比、附睪脂肪大小和脂肪質(zhì)量、脂體比，與高脂飲食組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對小鼠血糖水平、糖耐量和胰島素耐量的影響

圖1 TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝體比和脂體比的影響

血糖檢測、糖耐量和胰島素耐量試驗結(jié)果見圖2，與對照組相比，TCDD染毒、高脂飲食或兩者聯(lián)合作用均使小鼠空腹血糖增加，餐后血糖增加，糖耐量曲線下面積增加，胰島素耐量曲線下面積增加(P均＜0.05)。此外，TCDD染毒和高脂飲食聯(lián)合作用的效果大于TCDD單獨處理和高脂飲食作用之和，表明TCDD可加重高脂飲食引起的糖耐量和胰島素耐量損傷，TCDD染毒和高脂飲食聯(lián)合作用對空腹血糖和餐后血糖的影響具有協(xié)同作用。

圖2 TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對血糖水平、糖耐量和胰島素耐量的影響

2.3 TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對小鼠肝細胞線粒體膜電位和ROS水平的影響

我們采用Rho123和DHE探針檢測線粒體膜電位和ROS水平，結(jié)果見圖3。高脂飲食組小鼠肝組織Rho123和DHE熒光，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(圖3)。與對照組相比，TCDD染毒、TCDD染毒聯(lián)合高脂飲食使小鼠肝組織Rho123和DHE熒光強度均增強(P＜0.05)。與高脂飲食組相比，聯(lián)合作用組小鼠肝組織Rho123和DHE熒光強度亦均增強(P＜0.05)。此外，聯(lián)合作用的效果大于TCDD染毒和高脂飲食作用之和。以上結(jié)果表明，TCDD誘導肝組織線粒體膜電位和ROS水平明顯增加，TCDD染毒和高脂飲食聯(lián)合作用對線粒體膜電位和ROS水平的影響具有協(xié)同作用。

2.4 TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對小鼠脂肪組織ROS水平的影響

脂肪組織ROS水平檢測結(jié)果見圖4。與對照組相比，TCDD染毒、高脂飲食或兩者聯(lián)合作用均使小鼠脂肪組織DHE熒光強度增強(P＜0.05)。與高脂飲食組相比，聯(lián)合作用組小鼠脂肪組織DHE熒光強度增強(P＜0.05)。此外，聯(lián)合作用的效果大于TCDD染毒和高脂飲食作用之和。以上結(jié)果表明，TCDD誘導脂肪組織的ROS水平明顯增加，TCDD和高脂飲食聯(lián)合作用對ROS水平的影響具有協(xié)同作用。

2.5 TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對小鼠脂肪組織抗氧化酶m RNA表達的影響

實時熒光定量PCR結(jié)果見圖5。與對照組相比，高脂飲食使小鼠脂肪組織Nrf2 mRNA水平升高，GCLc mRNA水平降低，GPx1 mRNA水平升高(P＜0.05)；TCDD染毒使小鼠脂肪組織Nrf2、GCLc和SOD2 mRNA水平均降低(P＜0.05)；TCDD染毒聯(lián)合高脂飲食使小鼠脂肪組織Nrf2、GCLc和SOD2 mRNA水平降低(P＜0.05)，而 GPx1 mRNA 水平升高(P＜0.05)。與高脂飲食組相比，聯(lián)合作用組小鼠脂肪組織Nrf2、GCLc和SOD2 mRNA水平均降低(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，TCDD染毒降低小鼠脂肪組織抗氧化酶的表達，TCDD和高脂飲食聯(lián)合作用對Nrf2和SOD2 mRNA表達的影響具有協(xié)同作用。

2.6 TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對小鼠脂肪組織炎癥因子mRNA表達的影響

圖3 TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對肝細胞線粒體膜電位和ROS水平的影響

圖4 TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對脂肪細胞ROS水平的影響

實時熒光定量PCR結(jié)果見圖6。與對照組相比，TCDD染毒、高脂飲食或兩者聯(lián)合作用均使小鼠脂肪組織 IL-1α、IL-6、MCP-1 mRNA 水平升高(P＜0.05)。與高脂飲食組相比，聯(lián)合作用組小鼠脂肪組織IL-1α、IL-6、MCP-1 mRNA水平均升高(P＜0.05)。此外，聯(lián)合作用的效果大于TCDD染毒和高脂飲食作用之和。以上結(jié)果表明，TCDD可誘導小鼠脂肪組織炎癥因子的表達，TCDD染毒和高脂飲食聯(lián)合作用對炎癥因子表達的影響具有協(xié)同作用。

圖5 TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對小鼠脂肪組織抗氧化酶m RNA表達的影響

圖6 TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對小鼠脂肪組織炎癥因子m RNA表達的影響

3 討論

環(huán)境因素和生活方式是肥胖、糖尿病等糖脂代謝紊亂疾病發(fā)生的重要原因。作為一種重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物和持久性有機污染物，二噁英(TCDD為主要代表)暴露與糖脂代謝紊亂密切相關(guān)。此外，過量營養(yǎng)攝入在肥胖、糖尿病等的發(fā)病中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。然而，以上兩種因素聯(lián)合作用對糖脂代謝的影響及機制還不明確。在本研究中，我們評價了TCDD單獨暴露或TCDD染毒和高脂飲食聯(lián)合對小鼠糖脂代謝的影響。本研究的結(jié)果提示，TCDD單獨暴露、TCDD染毒與高脂飲食聯(lián)合均可誘導小鼠糖脂代謝紊亂，主要表現(xiàn)為附睪脂肪組織含量增加、血糖水平的升高和糖耐量、胰島素耐量受損。與單獨作用相比，TCDD和高脂飲食聯(lián)合作用對糖脂代謝的影響明顯增強，提示TCDD和高脂飲食聯(lián)合暴露導致糖脂代謝紊亂的危險性顯著增加。

在糖脂代謝的調(diào)節(jié)過程中，肝和脂肪組織的作用至關(guān)重要。肝組織通過調(diào)節(jié)糖異生、糖原合成與分解、脂質(zhì)合成與分解影響糖脂代謝。脂肪組織，是由脂肪細胞組成的一種疏松結(jié)締組織，在哺乳動物體內(nèi)存在兩種脂肪組織：白色脂肪組織和棕色脂肪組織[13-14]。作為一個具有新陳代謝功能的器官，白色脂肪組織的作用在于脂質(zhì)的攝取、合成和以甘油三酯形式的儲存。一旦細胞處于能量缺乏的情況，例如空腹，儲存在白色脂肪中的甘油三酯會進行脂肪動員，分解為游離脂酸和甘油，以用作細胞的能量來源[15]。一些使用脂肪缺乏或脂肪代謝障礙模型的研究證明了在缺乏功能完整的脂肪細胞時，甘油三酯會傾向于儲存于肝臟或肌肉中，使機體產(chǎn)生胰島素抵抗[16-17]。機體的氧化還原穩(wěn)態(tài)對于多種正常生理、生化過程至關(guān)重要，氧化還原失衡導致氧化應(yīng)激，是多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要誘因。過量的ROS可以通過直接損傷DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子或作為信號分子影響信號傳遞等方式，調(diào)節(jié)機體多種功能。文獻和本課題組前期的研究表明，氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡致氧化應(yīng)激在肥胖和2型糖尿病等疾病中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。線粒體氧化磷酸化和各種代謝酶是細胞內(nèi)ROS最主要的來源。在本研究中，我們重點關(guān)注了TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食對肝和脂肪組織氧化應(yīng)激的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在肝組織中，TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食可以顯著誘導肝組織線粒體超極化和ROS水平增加，并且TCDD和高脂飲食聯(lián)合作用對線粒體和ROS的影響顯著增強。在脂肪組織中，TCDD染毒或聯(lián)合高脂飲食可以顯著促進ROS生成，且TCDD和高脂飲食聯(lián)合作用對ROS的影響顯著增強。結(jié)果提示，TCDD和高脂飲食聯(lián)合作用可以顯著增強誘導的氧化應(yīng)激。

基于氧化還原反應(yīng)的多來源、多環(huán)節(jié)、多靶點、瞬時反應(yīng)、鏈式反應(yīng)與抗氧化的相對靶向性等特點，本課題組提出了“氧化還原鏈”的概念[18-19]：氧化還原系統(tǒng)的各種復雜分子構(gòu)成了不同水平的氧化還原鏈，主要包括ROS鏈、ROS生成酶鏈、抗氧化復合鏈和轉(zhuǎn)錄因子鏈等。細胞內(nèi)一種ROS通常會通過鏈式反應(yīng)產(chǎn)生其他類型的ROS，某一位點生成的ROS也會誘發(fā)其他部位生成ROS，這些在不同時空位點生成的ROS構(gòu)成“ROS鏈”。ROS主要由各種關(guān)鍵酶所產(chǎn)生，主要包括線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中ROS生成酶、NADPH氧化酶(NOXs)、黃嘌呤氧化酶(XOR)、一氧化氮合酶(NOS)、脂氧合酶(LOX)、環(huán)氧合酶(COX)、細胞色素P450酶系(CYPs)以及其他未確定的ROS生成酶。這些ROS生成酶在廣泛分布在細胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位，構(gòu)成ROS生成酶鏈。在不同的生理病理條件下，ROS生成酶鏈的特定酶被激活，生成ROS。不同的生理病理條件決定了某種或多種ROS生成酶被激活。細胞內(nèi)持續(xù)不斷地生成ROS，抗氧化防御系統(tǒng)對于對抗ROS、維持氧化還原的動態(tài)平衡至關(guān)重要，這個抗氧化防御系統(tǒng)構(gòu)成了抗氧化復合鏈，其由抗氧化非酶鏈和抗氧化酶鏈構(gòu)成?？寡趸敲告準侵钢苄约八苄缘亩喾N抗氧化劑及抗氧化大分子組成，它是機體抵抗ROS威脅的第一道防線。一系列催化氧化還原反應(yīng)的抗氧化酶構(gòu)成了對抗?jié)撛谘趸瘬p傷的第二道防線——抗氧化酶鏈，主要包括SOD、CAT、GCL、GPx、GST、Trx、Prx、HO-1、NOQ1、硒蛋白P和基質(zhì)金屬蛋白酶(MTs)等。一般認為，在氧化與抗氧化的對抗中，氧化處于優(yōu)勢地位。抗氧化非酶鏈和抗氧化酶鏈聯(lián)合構(gòu)成抗氧化復合鏈，抵御潛在的氧化威脅，維持氧化還原的動態(tài)平衡。此外，氧化還原穩(wěn)態(tài)還受到更高水平的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，這些氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子鏈，主要包括Nrf2、PGC-1α、p53、NF-κB和FoxOs等。這些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，共同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)ROS生成酶和抗氧化復合鏈，在更高的水平動態(tài)調(diào)控氧化還原平衡。此外，表觀遺傳和翻譯后修飾等一些新的調(diào)控機制也可以通過影響各種氧化還原鏈而調(diào)節(jié)氧化還原平衡。這些氧化還原鏈在不同的時空位相發(fā)生精細的相互作用，共同調(diào)控氧化還原穩(wěn)態(tài)。其中，Nrf2是調(diào)控氧化還原平衡的核心轉(zhuǎn)錄因子，已知的絕大部分抗氧化酶，如SOD、CAT、GCL、GPx、HO-1、NOQ1等，都受到Nrf2的調(diào)控。Nrf2與其調(diào)控的各種抗氧化酶共同構(gòu)成Nrf2-抗氧化酶鏈，是機體內(nèi)最為重要的抗氧化防御體系。在本研究中，我們評價了TCDD和高脂飲食對脂肪組織Nrf2及關(guān)鍵抗氧化酶的影響，發(fā)現(xiàn)，TCDD可以顯著降低Nrf2、GCLc和SOD2的表達，TCDD和高脂飲食聯(lián)合作用，Nrf2及關(guān)鍵抗氧化酶的下降更為顯著。結(jié)果提示，TCDD和高脂飲食聯(lián)合作用對Nrf2及關(guān)鍵抗氧化酶的影響可能是其誘導氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因素。

此外，白色脂肪還是一個重要的內(nèi)分泌器官，分泌脂聯(lián)素、acrp30等脂肪因子，和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor- α， TNF- α)、 白 介 素 -1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-1α、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等促炎性細胞因子[20]。這些炎癥因子可以激活多種信號通路，并與氧化應(yīng)激相互促進，最終導致胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TCDD和高脂飲食使脂肪組織IL-1α、IL-6和MCP-1的表達顯著升高，且聯(lián)合作用組升高得更為明顯。結(jié)果提示，TCDD和高脂飲食可以產(chǎn)生協(xié)同作用，促進炎癥因子表達。

本研究提示，TCDD和高脂飲食可產(chǎn)生協(xié)同作用，導致糖脂代謝功能紊亂。肝組織和脂肪組織是TCDD和高脂飲食影響糖脂代謝的重要靶器官。氧化應(yīng)激和炎癥可能是TCDD和高脂飲食聯(lián)合作用導致糖脂代謝紊亂的重要機制。Nrf2及其調(diào)控的抗氧化酶可能是TCDD和高脂飲食聯(lián)合作用的關(guān)鍵靶點。還需進一步的實驗明確TCDD和高脂飲食聯(lián)合作用影響Nrf2抗氧化系統(tǒng)以及糖脂代謝的分子機制，為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物相關(guān)糖脂代謝紊亂的干預(yù)提供實驗基礎(chǔ)。