陳 頤，趙應(yīng)偉，徐安傳，鄭志云，高德富，王 飛，王津軍，鄒聰明，李天福*

(1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650031；2.云南省香料煙有限責(zé)任公司，云南 保山 678000；3.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，云南 昆明 650202；4.云南省煙草公司玉溪市公司，云南 玉溪 652800；5.云南省煙草公司昆明市公司，云南 昆明 650000；6.福建省煙草公司三明市公司，福建 三明 365000)

【研究意義】煙葉的采收成熟度是影響煙葉品質(zhì)和外觀質(zhì)量的重要因素，也是烤煙分級標(biāo)準(zhǔn)中考慮的第一要素[1-2]。由于生產(chǎn)中對煙葉的采收成熟度把握不準(zhǔn)，存在青煙采烤現(xiàn)象，烤后煙葉化學(xué)成分不協(xié)調(diào)，抽吸質(zhì)量表現(xiàn)為香氣質(zhì)差、香氣量不足，刺激性明顯，青雜氣略重，潛在質(zhì)量特征未充分彰顯，煙葉內(nèi)在品質(zhì)有較大提升空間[3-4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】美國、巴西、津巴布韋等國外優(yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)混合型烤煙，對煙葉原料的成熟度要求較高，也試圖找到科學(xué)精準(zhǔn)反映烤煙成熟標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)外在特征[5]。其中日本采用比色卡來判斷煙葉成熟度，生產(chǎn)實(shí)踐中不易操作[6]；美國采用煙葉采收時(shí)的莖葉夾角以及葉柄是否帶莖皮等方法來判斷，仍不夠精準(zhǔn)[7]；而中國判斷煙葉成熟度的方法大多數(shù)是依據(jù)煙葉顏色、外觀特征等方面，上述研究大多局限在外觀特征的描述上，以顏色變化作為依據(jù)，主觀因素大，對鮮煙葉成熟特征缺乏定量判斷標(biāo)準(zhǔn)[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者以鮮煙葉的植物學(xué)特性為基礎(chǔ)，并分析不同采收成熟度下鮮煙葉光合特性、主要化學(xué)成分、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)對初烤煙葉產(chǎn)值、產(chǎn)量、內(nèi)在化學(xué)成分以及感官質(zhì)量的影響，篩選出產(chǎn)質(zhì)量高、化學(xué)成分協(xié)調(diào)的處理，然后進(jìn)行反推，最終確定能表征K326產(chǎn)質(zhì)量高的成熟度鮮煙葉素質(zhì)指標(biāo)及參數(shù)，從而提高煙葉的易烤性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為鞏固云南省優(yōu)質(zhì)特色煙葉K326原料優(yōu)勢提供新的思路和方向，對促進(jìn)云南兩煙持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和戰(zhàn)略意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和地點(diǎn)

供試品種為K326，由玉溪中煙種子有限責(zé)任公司提供。試驗(yàn)于2015和2016年在云南省玉溪市華寧縣寧州鎮(zhèn)董家山(海拔1647 m，N 24°11′42″，E 102°55′31″)進(jìn)行。前茬作物為玉米，土壤類型為紅壤，肥力水平中等，基本理化性狀：pH 6.40，有機(jī)質(zhì)10.7 g/kg，堿解氮82.0 mg/kg，速效鉀160.0 mg/kg，速效磷90.0 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組排列，共設(shè)3個(gè)處理，重復(fù)3次，共9個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積66.7 m2，植煙110株，行距1.2 m，株距0.5 m，合理設(shè)置保護(hù)行，以減少試驗(yàn)誤差。采用膜下小苗移栽，時(shí)間4月19-24日。移栽時(shí)施N∶P2O5∶K2O(12∶6∶24)的烤煙專用復(fù)合肥75 kg/hm2，栽后10～15 d施提苗肥，35 d揭膜培土，65～70 d封頂，打頂后7 d選取田間長勢一致的10株煙跟蹤取樣。以當(dāng)?shù)氐膶?shí)際情況進(jìn)行采收，以中部葉為試驗(yàn)材料，按尚熟、適熟和過熟3種成熟度田間鮮煙葉取樣。其處理為：處理1(尚熟)：正常采烤當(dāng)天，栽后(85±2)d；處理2(適熟)：正常采烤后6～7 d，栽后(92±2)d；處理3(過熟)：正常采烤后10～12 d，栽后(97±2)d。

1.3 檢測項(xiàng)目與方法

植物學(xué)特性分析：鮮煙葉成熟期植物學(xué)特性指標(biāo)有葉色、葉表面及莖葉角度、主脈色澤、支脈色澤、成熟斑、茸毛脫落程度、葉尖葉緣變化情況等。

光合特性分析：于烤煙成熟期每小區(qū)各處理隨機(jī)選擇10片煙葉，測定葉片SPAD值。

化學(xué)成分分析：煙葉成熟后，每小區(qū)各個(gè)處理取中部鮮煙葉各20片，殺青后按煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9-13]檢測鮮煙葉的含糖化合物(總糖、還原糖、淀粉等)和含氮化合物(總氮、煙堿、蛋白質(zhì)等)；每小區(qū)各個(gè)處理取C3F初烤煙葉各3 kg，按煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法[9-13]測定初烤煙葉的常規(guī)化學(xué)成分(總糖、還原糖、煙堿等)。

石蠟切片的取樣方法：剪取所取樣品的中脈兩側(cè)約0.5 cm×0.5 cm 的小塊，材料用FAA固定，常規(guī)石蠟切片法，切片厚度為10 μm，蘇木精染色，加拿大樹膠封片，制成永久制片。用顯微鏡觀察拍照[14]。

掃描和投射電鏡的取樣方法：取樣時(shí)，避開葉片主脈和大的側(cè)脈、剪取不同成熟度的煙株中部葉，剪成3 mm×3 mm，置于青霉素小瓶中，使葉片充分浸泡在4 %戊二醛固定液中固定，于4 ℃保存，用于后續(xù)透射電鏡的觀察，觀測指標(biāo)為全細(xì)胞、葉綠體等超微結(jié)構(gòu)[15]。

經(jīng)濟(jì)性狀分析：依據(jù)GB/2635-1992，測定每個(gè)小區(qū)烤煙的實(shí)際產(chǎn)量、產(chǎn)值、均價(jià)和中上等煙比例。

感官質(zhì)量分析：煙葉樣品的感官質(zhì)量由紅塔集團(tuán)技術(shù)中心進(jìn)行評價(jià)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均采用EXCEL、SPSS17.0等分析軟件進(jìn)行方差分析、計(jì)算和統(tǒng)計(jì)作表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度鮮煙葉植物學(xué)特性比較

3個(gè)成熟度的植物學(xué)特性見表1，隨著煙葉成熟度的提高，煙葉的顏色由綠黃向黃色轉(zhuǎn)變，最終變成黃白；主脈和支脈的顏色逐漸變白，其中主脈由尚熟的40 %提高到80 %，同樣支脈則由尚熟的20 %提高到60 %；煙葉莖葉夾角增大，葉尖下勾和葉緣下卷幅度增大；成熟斑變多，由尚熟的50 %提高到90 %，茸毛脫落增多，由尚熟的不脫落提高到脫落75 %。

2.2 不同成熟度鮮煙葉光合特性及主要化學(xué)成分比較

葉片SPAD值取決于葉綠素對特定波段光線的吸收，讀數(shù)越大說明葉綠素含量越高[16]。從表2可知，不同成熟度鮮煙葉SPAD值存在極顯著差異(P<0.01)，其中尚熟鮮煙葉SPAD值顯著高于適熟和過熟，表明鮮煙葉葉綠素含量隨煙葉成熟度提高而顯著下降。

表1 不同處理下K326鮮煙葉植物學(xué)特性分析

表2 不同處理下K326鮮煙葉SPAD值和主要化學(xué)成分分析

注：同列不同小寫字母表示差異達(dá)5 %顯著水平，同列不同大寫字母表示差異達(dá)1 %顯著水平，下同。

Note: Different lower case letters in the same column mean significant difference at 5 % level. Different capital letters in the same column mean significant difference at 1 % level. The same as below.

不同成熟度處理下鮮煙葉總糖、還原糖、淀粉和蛋白質(zhì)含量存在極顯著性差異(P<0.01)。K326鮮煙葉總糖含量和還原糖含量大小表現(xiàn)為適熟>尚熟>過熟，而在淀粉含量上表現(xiàn)為尚熟>適熟>過熟。K326鮮煙葉蛋白質(zhì)含量大小表現(xiàn)為適熟>尚熟>過熟，表明不同成熟度處理對鮮煙葉含糖化合物和含氮化合物產(chǎn)生了較大影響。

2.3 不同成熟度鮮煙葉組織結(jié)構(gòu)比較

由表3可知，不同成熟度處理下K326鮮煙葉柵欄組織厚度和海綿組織厚度存在極顯著性差異(P<0.01)，指標(biāo)大小均表現(xiàn)為適熟期>過熟期>尚熟期。由此可見，尚熟期、適熟期和過熟期煙葉組織細(xì)胞形態(tài)差異很大，其中適熟期烤煙品種K326的柵欄組織厚度為58.94 μm，海綿組織厚度為68.54 μm。

2.4 不同成熟度鮮煙葉細(xì)胞和葉綠體超微結(jié)構(gòu)比較

由圖1細(xì)胞超微觀察結(jié)果顯示：尚熟期鮮煙葉細(xì)胞輪廓清晰，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁與細(xì)胞膜緊密相連，沒有質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細(xì)胞排列整齊；適熟期煙葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與尚熟期相似，不同的是細(xì)胞間存在少量間隙，間隙度較尚熟煙葉大，間隙適度，煙葉更有彈性；過熟期鮮煙葉整體細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁與細(xì)胞膜緊密相連，細(xì)胞壁平滑，沒有發(fā)生皺縮，但細(xì)胞間的間隙程度較尚熟期和適熟期的煙葉大。

葉綠體超微觀察結(jié)果顯示：尚熟期鮮煙葉可以在細(xì)胞中清晰的觀察到葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，葉綠體結(jié)構(gòu)完整，雙層膜輪廓清晰，內(nèi)部基粒結(jié)構(gòu)清楚，基粒個(gè)數(shù)較多，每個(gè)基粒的類囊體數(shù)量較多，基粒片層完整，葉綠體中有大量淀粉顆粒的積累，但淀粉顆粒較小，顯示為積累初期，葉綠體沿著細(xì)胞壁分布為橢圓形。適熟期煙葉葉綠體超微結(jié)構(gòu)與尚熟期相似，但基粒個(gè)數(shù)及基粒的類囊體數(shù)量均較尚熟期少，基粒片層完整，葉綠體中的淀粉顆粒的積累量較尚熟期多，但淀粉顆粒較小。過熟期鮮煙葉葉綠體的超微結(jié)構(gòu)顯示葉綠體外膜已不完整，雙層膜輪廓模糊，內(nèi)部基粒結(jié)構(gòu)模糊，基粒個(gè)數(shù)較成熟期減少，類囊體數(shù)量都較適熟期少。

表3 不同處理下K326鮮煙葉組織結(jié)構(gòu)分析

a：尚熟(細(xì)胞)；圖b：適熟(細(xì)胞)；圖c：過熟(細(xì)胞)；圖d：尚熟(葉綠體)；圖e：適熟(葉綠體)；圖f：過熟(葉綠體)；CW：細(xì)胞壁；IS：細(xì)胞間隙；Ch：葉綠體；Chm：葉綠體膜；Th：基質(zhì)類囊體；S：淀粉粒；GL：基粒片層；SL：基質(zhì)片層a: Yet-maturity (cell); b: Proper maturity (cell); c: Over-maturity (cell); d: Yet-maturity (chloroplast); e: Proper maturity (chloroplast); f: Over-maturity (chloroplast); CW: Cell way; IS: Intercellular space; Ch: Chloroplast; Chm: Chloroplast membrane; Th: Thylakoid; S: Starch grain; GL: Grana lamella; SL: Stroma lamella圖1 不同采收成熟度K326鮮煙葉細(xì)胞和葉綠體超微結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Ultrastructure of fresh leaf cells and chloroplasts of K326 with different harvest maturity

2.5 不同成熟度對初烤煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值的影響

如表4可知，不同成熟度處理下的烤煙品種K326初烤煙葉產(chǎn)值、上等煙比例和均價(jià)存在極顯著差異(P<0.01)，均以適熟處理下的初烤煙葉產(chǎn)值最高，尚熟葉次之，過熟葉最低。雖然尚熟煙葉平均產(chǎn)量比適熟葉高，但由于等級結(jié)構(gòu)偏低，其平均單價(jià)低于適熟葉，所以產(chǎn)值高于尚熟煙葉。

2.6 不同成熟度對初烤煙葉內(nèi)在化學(xué)成分的影響

如表5所示，不同成熟度處理下的烤煙品種K326初烤煙葉總糖、還原糖、淀粉、總氮、煙堿和蛋白質(zhì)含量存在顯著差異(P<0.05)。一般認(rèn)為優(yōu)質(zhì)煙化學(xué)成分品質(zhì)指標(biāo)糖堿比的比值接近10，總氮與煙堿的比值接近1為最佳。以適熟處理糖堿比和氮堿比指標(biāo)與優(yōu)質(zhì)煙更為接近。

2.7 不同成熟度對初烤煙葉感官評吸質(zhì)量的影響

從表6可見，從尚熟至成熟，煙葉吃味變醇和，雜氣和勁頭減小，香氣量提高，余味變好，但過熟時(shí)煙葉的枯焦雜氣明顯，感官質(zhì)量明顯變差。不同成熟度K326初烤煙葉的感官質(zhì)量總分大小為適熟>尚熟>過熟。

3 討 論

通過試驗(yàn)研究烤煙品種K326不同成熟度處理下鮮煙葉素質(zhì)差異以及對初烤煙葉產(chǎn)質(zhì)量和感官質(zhì)量的影響，得出煙葉產(chǎn)質(zhì)量和感官質(zhì)量適熟處理明顯優(yōu)于其他處理，來反推鮮煙葉素質(zhì)，鮮煙葉素質(zhì)顯著差異指標(biāo)具體表現(xiàn)在植物學(xué)特性、光合特性、化學(xué)成分、組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上。

表4 不同處理下K326初烤煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值分析

表5 不同處理下K326初烤煙葉內(nèi)在化學(xué)成分分析

表6 不同處理下K326初烤煙葉感官評吸質(zhì)量分析

3.1 影響烤煙產(chǎn)質(zhì)量的鮮煙葉植物學(xué)特性指標(biāo)

劉偉等[17]研究表明，煙葉的采收成熟度對煙葉的品質(zhì)有重要影響，能否準(zhǔn)確把握煙葉的采收成熟度，將決定采烤煙葉品質(zhì)的優(yōu)劣。以鮮煙葉的植物學(xué)特性來判斷煙葉成熟度是目前最直觀和方便的方法，有利于煙農(nóng)在田間第一時(shí)間進(jìn)入最佳時(shí)期進(jìn)行采收，因此篩選田間煙葉最佳采烤成熟度及煙葉成熟時(shí)期植物學(xué)形態(tài)對提高煙葉產(chǎn)質(zhì)量具有舉足輕重的作用。本研究結(jié)果產(chǎn)質(zhì)量較好的適熟期中部煙葉的顏色：葉色淺黃，葉片落黃80 %，主脈變白60 %，支脈變白40 %；形態(tài)方面：葉尖下勾，葉緣下卷，葉表面皺褶，莖葉角度70°；成熟斑達(dá)到70 %，茸毛脫落將近50 %，這與王懷珠等[18]研究結(jié)果相似。

3.2 影響烤煙產(chǎn)質(zhì)量的鮮煙葉光合特性和主要化學(xué)成分指標(biāo)

多數(shù)理化指標(biāo)受品種、部位和成熟度的影響均較大。就品種而言，紅大的色素明顯高于K326，總氮、蛋白質(zhì)、硝酸還原酶活性和淀粉酶活性K326明顯高于紅大[19]；就部位而言，色素和硝酸還原酶活性均是隨采收部位的上升而不斷減小，類胡蘿卜素比值、丙二醛、淀粉酶活性、蛋白質(zhì)和總氮的含量均隨采收部位的上升而增加[20-22]。本研究結(jié)果產(chǎn)質(zhì)量較好的適熟期中部煙葉的SPAD值為23.5，總糖含量為14.02 %，還原糖含量為10.63 %，淀粉含量為25.42 %，蛋白質(zhì)含量為12.02 %。

3.3 影響烤煙產(chǎn)質(zhì)量的鮮煙葉組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

鮮煙葉的組織結(jié)構(gòu)受部位和成熟期的影響較大，受烤煙品種的影響較小[23]。徐興陽等[24]研究表明，煙葉成熟度從尚熟到過熟轉(zhuǎn)變過程中，煙葉的組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為從緊密到疏松再到緊密的變化趨勢。其中葉片厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度、葉表皮厚度、組織比等指標(biāo)，隨著成熟度增加均呈現(xiàn)“拋物線”變化規(guī)律，均表現(xiàn)為具有一個(gè)標(biāo)志性的拐點(diǎn)。本研究結(jié)果產(chǎn)質(zhì)量較好的適熟期中部煙葉的柵欄組織厚度為58.94 μm，海綿組織厚度為68.54 μm，極顯著高于尚熟期和過熟期煙葉。

齊虹凌等[25]研究表明，組織結(jié)構(gòu)疏密適當(dāng)?shù)臒熑~，細(xì)胞間隙大，利于細(xì)胞體內(nèi)各種化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化和水分排除，更易形成優(yōu)質(zhì)煙葉。不同成熟度煙葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和組織結(jié)構(gòu)的差異在一定程度上反映了煙葉細(xì)胞生理生化反應(yīng)、內(nèi)含物降解轉(zhuǎn)化的不同[26]。本研究電鏡觀察結(jié)果煙葉細(xì)胞的差異具體表現(xiàn)在葉綠體等細(xì)胞器與細(xì)胞壁的緊貼程度以及間隙大小上，其中適熟煙葉細(xì)胞間隙度較尚熟大，間隙較適度，煙葉更有彈性。另外，還發(fā)現(xiàn)適熟期煙葉基粒個(gè)數(shù)及基粒的類囊體數(shù)量均較尚熟期少，基粒片層完整，葉綠體中的淀粉顆粒的積累量較尚熟期多，但淀粉顆粒較小，且葉綠體逐漸由與細(xì)胞壁的緊貼狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x狀態(tài)。

4 結(jié) 論

本研究系統(tǒng)地提出了一套能表征影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量及易烤性的田間鮮煙葉素質(zhì)指標(biāo)及參數(shù)，其指標(biāo)包括植物學(xué)特性、光合特性、主要化學(xué)成分、組織結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。由于煙葉成熟度受多種因素的影響，如品種、部位、生態(tài)因素等，因此，對在不同生態(tài)因素下不同品種、不同部位煙葉的成熟特征需要專門的研究。