朱買勛，張邑帆，付利芝，徐登峰，周 雪

(重慶市畜牧科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 榮昌 402460)

【研究意義】豬流感(Swine influenza)是由豬流感病毒(swine influenza virus，SwIV)引起的一種人畜共患病。該病毒在病毒感染、增殖過(guò)程中容易引起病毒免疫逃逸，可能引起病毒侵襲宿主的受體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生生物學(xué)活性改變，能不同動(dòng)物種源間傳播，侵害其免疫系統(tǒng)，影響生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重危害豬、禽、人的健康?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】SwIV屬于正黏病毒科的A型流感病毒，是一種溫和型、高傳染性的呼吸道疾病，臨床上以發(fā)熱、厭食、呼吸困難、咳嗽等臨床癥狀為主，未出現(xiàn)其他的典型癥狀。在我國(guó)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的流感病毒亞型有H1N1、H3N2、H1N2、H9N2、H5N1等，在豬群間廣泛流行的流感病毒有典型豬H1N1、類禽型H1N1和類人型H3N2亞型毒株[1-2]。豬只在短暫感染豬流感病毒后，其先天性免疫系統(tǒng)在受到侵害的同時(shí)，還會(huì)激發(fā)機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)，促進(jìn)組織細(xì)胞分泌抗病毒類細(xì)胞因子，如干擾素、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素等，參與機(jī)體的抗病毒作用，使患病豬在短期內(nèi)快速恢復(fù)[3-5]。給仔豬滴鼻感染H3N2病毒，在感染病毒后第5天特異性sIgA的抗體水平會(huì)迅速升高，積極的參與機(jī)體的免疫應(yīng)答[6]。如果病毒的毒力較強(qiáng)或者病毒的持續(xù)感染，會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷豬的免疫系統(tǒng)，抑制感染豬的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)豬對(duì)疾病的易感性。在體外用SwIV分離株感染豬肺巨噬細(xì)胞，72 h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，凋亡細(xì)胞達(dá)25 %，推測(cè)SwIV可以誘導(dǎo)豬肺巨噬細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制[7]。H3N2亞型流感病毒還會(huì)出現(xiàn)抗原漂移現(xiàn)象，引起宿主免疫逃逸，形成新的流行[8]。在防治過(guò)程中，主要方式是接種疫苗進(jìn)行免疫，SwIV對(duì)烷胺類藥物有明顯的耐藥性[9]。 【本研究的切入點(diǎn)】重慶是西南地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)比較集中地區(qū)，養(yǎng)豬業(yè)占據(jù)了主要部分，每年因疾病造成了巨大的損失。SwIV感染豬群一般不會(huì)有典型的臨床征兆，還未來(lái)得及進(jìn)行疾病治療就造成動(dòng)物的損傷，影響?zhàn)B豬業(yè)的生產(chǎn)。但是SwIV在重慶地區(qū)的流行調(diào)查還未受到重視。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為了明確H3N2型SwIV對(duì)仔豬組織臟器引起的損傷變化，本研究使用H3N2型SwIV人工感染仔豬，分析該病毒對(duì)榮昌仔豬組織臟器的損傷及其在組織中的載毒情況，可以使臨床中實(shí)施SwIV防治更有針對(duì)性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和病毒 試驗(yàn)仔豬，榮昌豬品系，25日齡，購(gòu)自重慶市育種豬場(chǎng)；雞胚，SPF級(jí)，10日齡，購(gòu)自濟(jì)南斯派瑞福禽業(yè)科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2014 0005；豬流感病毒，H3N2亞型，由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所分離鑒定，并做保存[10]。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒，Solarbio公司產(chǎn)品； One step RT-PCR Kit，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，Swine Infuenza (H1N1) Antibody Test Kit、Swine Infuenza (H3N2) Antibody Test Kit，BIOVET公司生產(chǎn)。

1.2 病毒的增殖培養(yǎng)

選用10日齡的SPF雞胚，用鉛筆畫(huà)出氣室和胚位，在氣室接近胚體處消毒后，用鋼錐穿一小孔，接種0.2 mL H3N2豬流感病毒液，石蠟封口，并置于孵化箱孵育，保持溫度(37±1) ℃，濕度50 %～60 %，每天檢胚2次，棄除24 h內(nèi)死亡雞胚，24～72 h內(nèi)死亡的胚胎置4 ℃冰箱30 min，收集尿囊液，收獲的尿囊液無(wú)菌檢驗(yàn)后在-80 ℃冰箱中保存。

1.3 病毒的鑒定

參照GenBank，選擇H3N2亞型SwIV毒株的HA基因序列(No.AF251419)設(shè)計(jì)引物，上游引物SwIV1：5’-GTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’，下游引物SwIV2：5’-CCTCTAGTTTGTTTCTCTGGTAC-3’，按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，按RT-PCR一步法試劑盒要求，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μl，Buffer 25 μl，上下游引物各1 μl，RNA模板5 μl，加ddH2O補(bǔ)足50 μl，反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 30 min； 94 ℃ 2 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s， 30個(gè)循環(huán)，75 ℃延伸10 min，取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，預(yù)期產(chǎn)物1065 bp。

1.4 病毒半數(shù)感染量測(cè)定

參照Reed-Muench法[11]，用病毒稀釋液把培養(yǎng)所得尿囊液進(jìn)行10倍梯度稀釋，從10-1稀釋至10-10，共10個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種9～11 d 的SPF雞胚5枚，接種量為0.1 mL/枚，37 ℃溫箱培養(yǎng)，逐日觀察至120 h，期間死亡的雞胚及時(shí)拿出冷藏4 h或過(guò)夜，收獲每枚雞胚的尿囊液，分離。用1 %雞紅細(xì)胞懸液做血凝試驗(yàn)，逐枚檢測(cè)雞胚尿囊液中病毒的血凝價(jià)，當(dāng)HA≥1∶128時(shí)判為感染，根據(jù)血凝價(jià)計(jì)算EID50。

1.5 仔豬感染SwIV病毒

在試驗(yàn)前，前腔靜脈采集仔豬血液2～3 mL，分離血清，采用ELISA檢測(cè)仔豬血清豬流感H1N1和H3N2抗體，選擇抗體為陰性仔豬進(jìn)行感染病毒。選擇6頭H1N1和H3N2抗體均為陰性的仔豬，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組3頭，試驗(yàn)組滴鼻攻毒H3N2 SwIV 5 mL/只，對(duì)照組滴鼻5 mL生理鹽水，觀察仔豬臨床癥狀。

1.6 臨床檢查及病理學(xué)觀察

豬流感潛伏期為1～3 d，持續(xù)感染6～7 d，試驗(yàn)選擇在接種病毒后第5天剖殺試驗(yàn)仔豬，檢查仔豬組織臟器的臨床變化。取病理變化較為嚴(yán)重的組織，用10 %甲醛固定，參照文獻(xiàn)操作，進(jìn)行組織切片的制作[12]。制作好的切片采用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄組織損傷變化。

1.7 仔豬組織載毒檢測(cè)

采集心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等組織，剪成2～3 mm2組織塊，迅速置于液氮中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PT-PCR檢測(cè)豬流感病毒在心、肝、脾、肺、腎和淋巴結(jié)中的載毒量。

2 結(jié)果與分析

2.1 SwIV增殖及鑒定

SwIV接種SPF雞胚后，24 h內(nèi)死亡3枚，檢查發(fā)現(xiàn)胚體質(zhì)軟易碎，全身出血；24～72 h內(nèi)死亡42枚，收集尿囊液約380 mL，-80 ℃保存，胚體弱小，全身出血；對(duì)照組雞胚直至72 h未死亡，雞胚正常發(fā)育，已長(zhǎng)出絨毛。從收集的雞胚尿囊液中提取病毒RNA，用HA引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，在1065 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符合，說(shuō)明收集的病毒液為目的病毒。

表1 H3N2感染雞胚結(jié)果

2.2 SwIV效價(jià)測(cè)定

病毒液經(jīng)血凝試驗(yàn)檢測(cè)出各個(gè)稀釋度病毒液的雞胚感染數(shù)(表1)，Reed-Muench法統(tǒng)計(jì)得出病毒液EID50為106.5/mL。

2.3 感染H3N2型SwIV仔豬的臨床和病理學(xué)變化

接種病毒后，試驗(yàn)組仔豬體溫升高，有輕微腹瀉，食欲正常，精神不振。剖解試驗(yàn)組仔豬發(fā)現(xiàn)肺臟邊緣淤血，表面有損傷壞死(圖2，見(jiàn)封三)；其他組織未見(jiàn)典型病變。取肺組織制作石蠟切片，觀察結(jié)果顯示試驗(yàn)組仔豬肺泡壁增厚，肺泡內(nèi)有纖維性滲出和炎癥細(xì)胞聚集，對(duì)照組仔豬肺泡完整，無(wú)異常變化(圖3，見(jiàn)封三)。

2.4 感染仔豬的載毒檢測(cè)

經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，在試驗(yàn)組仔豬肺臟樣品中檢測(cè)出H3N2型 SwIV，而心、肝、脾、腎臟和淋巴結(jié)檢測(cè)結(jié)果均為陰性(圖4)，說(shuō)明H3N2型 SwIV主要感染于仔豬的肺臟組織。

3 討 論

豬流感是由A型流感病毒引起的急性呼吸道疾病，在豬群間基本沒(méi)有其流行的臨床征兆。SwIV侵入機(jī)體時(shí)，在呼吸道和消化道黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖，隨著病毒的增殖和損傷，引起動(dòng)物精神倦怠，咳嗽，食欲不振等輕微的臨床癥狀。這個(gè)時(shí)候會(huì)激起機(jī)體的免疫，最終形成自然恢復(fù)的現(xiàn)象。如果病毒的持續(xù)感染，導(dǎo)致上皮細(xì)胞感染，進(jìn)一步損傷組織器官，要表現(xiàn)出典型的組織病變和相應(yīng)的癥狀，流感病毒濃度值必須達(dá)到一定的量。試驗(yàn)中仔豬在滴鼻接種H3N2亞型SwIV后，仔豬未出現(xiàn)典型的臨床癥狀，但是肺臟組織已經(jīng)受到嚴(yán)重的損傷，肺泡壁增厚，肺泡內(nèi)有纖維性滲出和炎癥細(xì)胞聚集。分析原因可能是病毒在肺臟組織中進(jìn)行擴(kuò)散，形成感染，造成組織損傷。但是病毒的量還只局限于局部臟器的損傷，流感病毒還沒(méi)有通過(guò)血流侵入血流中致使機(jī)體發(fā)生典型的臨床癥狀。

1：陽(yáng)性對(duì)照；2：病毒液1: Positive control; 2: Viral solution圖1 豬流感HA基因RT-PCR結(jié)果 Fig.1 RT-PCR result of SwIV HA gene

對(duì)感染H3N2型 SwIV組織載毒情況分析，在肺臟組織中檢測(cè)到病毒，脾臟、肝臟、腎臟、心臟、淋巴結(jié)中均沒(méi)有檢測(cè)到SwIV，說(shuō)明H3N2型 SwIV在感染仔豬時(shí)病毒主要蓄積在肺臟組織。大量的SwIV聚集在肺臟組織中，由于肺部病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)量不高，機(jī)體表現(xiàn)出輕微感染癥狀，病毒在呼吸道的含量及達(dá)到產(chǎn)生感染性病毒的細(xì)胞因子的程度，但是機(jī)體經(jīng)過(guò)免疫刺激后，流感病毒中原有的抗病毒的細(xì)胞因子消失[13]。

1：心臟；2：肝臟；3：脾臟；4：肺臟；5：腎臟；6：淋巴結(jié)1: Heart; 2:Liver; 3: Spleen; 4: Lung; 5：Lidneys；6: Lymph nodes圖4 仔豬組織中H3N2豬流感病毒HA基因檢測(cè)Fig.4 RT-PCR result of major organs in pigs infected with H3N2 SwIV

結(jié)合H3N2型 SwIV感染仔豬的臨床變化和組織病理學(xué)分析，在防治SwI的時(shí)候，雖然臨床上還未表現(xiàn)出典型的臨床癥狀，但可能已經(jīng)造成了組織器官的損傷，且H3N2型 SwIV主要載毒在肺臟組織中，臨床治療過(guò)程中應(yīng)當(dāng)注意組織器官的修復(fù)，尤其是肺臟組織。此外，由于傳播方式比較廣，還要注意疫苗進(jìn)行預(yù)防，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)SwIV的長(zhǎng)期監(jiān)控，做到疾病凈化，防止SwI在人畜間的傳播[14]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示感染H3N2型SwIV仔豬不一定出現(xiàn)典型臨床癥狀，但其組織受到嚴(yán)重?fù)p傷，且主要載毒于肺臟組織。