吳丹

（滇西科技師范學(xué)院 生物技術(shù)與工程學(xué)院，云南臨滄 677000）

微衛(wèi)星（Microsatellite）又稱短串聯(lián)重復(fù)序列（Short tandem repeats，STR），是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)。真核生物基因組中廣泛存在著串聯(lián)重復(fù)序列，Tautz（1993） 將重復(fù)單位在1～5bp，長(zhǎng)度為幾百bp的位點(diǎn)稱為微衛(wèi)星序列[1]。微衛(wèi)星由核心序列和側(cè)翼序列組成，側(cè)翼序列比較保守，核心序列重復(fù)數(shù)的差異則形成了微衛(wèi)星高度的多態(tài)性。微衛(wèi)星具有突變速率快、多態(tài)性高等特性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物遺傳作圖、群體遺傳研究、個(gè)體親緣關(guān)系鑒定等研究中。

在野生動(dòng)物非法盜獵和走私等案件中，涉案的動(dòng)物個(gè)體數(shù)是量刑的主要依據(jù)之一。然而有時(shí)查沒的野生動(dòng)物及其產(chǎn)品難以從外形上判斷出個(gè)體的數(shù)量，因此，利用微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)涉案動(dòng)物及其產(chǎn)品進(jìn)行個(gè)體識(shí)別可作為野生動(dòng)物保護(hù)的重要技術(shù)手段。

紫貂（Martes zibellina）隸屬于哺乳綱（Mammalia）、食肉目（Canirora）、鼬科（Mustelidae）、鼬亞科（Mustelinae）、貂屬（Martes），是我國國家一級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物。紫貂因其貂皮絨毛細(xì)密豐厚，峰毛高爽靈活，墨潤(rùn)有光且皮板較薄而為裘皮之冠[2]，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。紫貂在我國曾分布廣泛，由于濫捕濫獵以及生境破碎化，野生紫貂種群受到嚴(yán)重破壞，至今僅分布在我國新疆和東北地區(qū)。雖然野生動(dòng)物馴養(yǎng)繁殖是對(duì)野外資源保護(hù)的重要手段，但紫貂由于特殊的生理特性，至今僅在俄羅斯、芬蘭等少數(shù)國家獲得了成功，我國自1957年開始也曾對(duì)紫貂進(jìn)行過人工養(yǎng)殖，人工養(yǎng)殖下種群曾增大到1000余只，但后來種群又持續(xù)下降[3]，目前紫貂在我國馴養(yǎng)繁殖的關(guān)鍵技術(shù)尚未攻克。為保護(hù)野生紫貂種群，在加大盜獵打擊力度的同時(shí)，也要建立必要的技術(shù)手段。因此，篩選出適用于紫貂種群的微衛(wèi)星位點(diǎn)，對(duì)紫貂的種群遺傳研究和野外資源保護(hù)都是十分有利的。

1 材料與方法

1.1 特異性引物的設(shè)計(jì)

因?yàn)橐獜囊粋€(gè)物種中分離出新的微衛(wèi)星位點(diǎn)是一個(gè)很大的實(shí)驗(yàn)室工程，而微衛(wèi)星在近緣物種間的種間擴(kuò)增具有很高的成功率。因此，利用已報(bào)道的近緣物種的微衛(wèi)星位點(diǎn)，通過實(shí)驗(yàn)篩選出適用于紫貂的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有很高的可行性。

本次實(shí)驗(yàn)用的引物序列來自石貂（Martes foina）、美洲貂（Martse americana）、水貂（Mustela vison）已發(fā)表的文獻(xiàn)中。實(shí)驗(yàn)之初共選擇了33對(duì)引物，用3個(gè)紫貂DNA樣本進(jìn)行反復(fù)PCR實(shí)驗(yàn)后（反應(yīng)體系見表1），最終篩選出12對(duì)能獲得準(zhǔn)確分型數(shù)據(jù)的引物[4]，引物名稱及序列見表2。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.2 紫貂樣本的來源

本次需進(jìn)行個(gè)體識(shí)別的樣本一共20個(gè)，來自2012年伊春市公安局查獲的紫貂，包括15張新鮮皮張，5具已剝皮尸體。從皮張下取下的肌肉樣本分別編號(hào)為1～15，從尸體頭骨上取下的肌肉樣本編號(hào)為A～E，采用酚氯法提取DNA。

1.3 數(shù)據(jù)分析原理和方法

利用微衛(wèi)星分型來認(rèn)定同一個(gè)體的原則是：所有位點(diǎn)上的基因型都相同，或者只有一個(gè)座位上的一個(gè)等位基因存在差別[5-6]。常用的個(gè)體識(shí)別參（Probability of Identity，P(ID)），是指無親緣關(guān)系或者同胞個(gè)體之間具有相同基因型的概率，它表示同一種群中任意兩個(gè)個(gè)體在多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上基因型完全一致的可能性[7]。

進(jìn)行個(gè)體鑒別時(shí)，法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)為P(ID)值在0.001～0.0001，即認(rèn)為這兩個(gè)個(gè)體具有不同的基因型，來自不同的個(gè)體[8]。

本研究用Gimlet Software v1.3.3計(jì)算12對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的聯(lián)合P(ID)值，并用Excel中的MStools插件對(duì)20個(gè)樣本PCR擴(kuò)增后的毛細(xì)管分型結(jié)果進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。

表2 12對(duì)引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的聯(lián)合P(ID)值

計(jì)算結(jié)果顯示，12對(duì)位點(diǎn)的聯(lián)合識(shí)別力很高，即使是個(gè)體中出現(xiàn)雙胞胎的情況，位點(diǎn)的錯(cuò)判率P(sib)只有0.00002085。因此，篩選出的12對(duì)位點(diǎn)是適用于紫貂的個(gè)體識(shí)別的。

Prod(biased)：矯正基因型相似概率；Prod(unbias)：無偏基因型相似概率；Prod(sibs)：雙胞胎基因型相似概率。

2.2 個(gè)體識(shí)別結(jié)果

用Excel中的MStools插件對(duì)20個(gè)樣本的毛細(xì)管電泳觀測(cè)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分型，部分分型結(jié)果見表3。結(jié)果顯示：樣本A、B、C、E與6、3、13、14在12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因的基因型都是一致的，它們分別屬于同一個(gè)體，即編號(hào)為6、3、13、14的皮張是從編號(hào)為A、B、C、E的紫貂尸體上剝下的。編號(hào)為D的樣本未與任一皮張對(duì)應(yīng)，屬于單獨(dú)的個(gè)體。所以，本次涉案的15張皮張和5具已剝皮紫貂尸體來自于16個(gè)不同的紫貂個(gè)體，也就是說本次涉案的紫貂個(gè)體數(shù)目為16只。

圖1 紫貂不同個(gè)體基因型相似概率曲線

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)從石貂、美洲貂和水貂中篩選出的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，能成功地應(yīng)用于紫貂的微衛(wèi)星擴(kuò)增及后續(xù)的遺傳統(tǒng)計(jì)分析。證明近緣物種間的微衛(wèi)星種間擴(kuò)增是可行的。

Zhang Y W等[9]利用人類引物成功對(duì)一對(duì)黑猩猩進(jìn)行了親緣鑒定；Xu等[10]用從家貓的微衛(wèi)星引物中篩選出的7對(duì)引物對(duì)老虎進(jìn)行了微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增；Mukesh[11]從雞的微衛(wèi)星座位中篩選出15個(gè)位點(diǎn)對(duì)喜馬拉雅棕尾虹雉進(jìn)行了種間擴(kuò)增，且這些位點(diǎn)也適用于另外三種雞形目鳥類。利用已報(bào)道的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行近緣物種之間的跨種間擴(kuò)增，在保證了實(shí)驗(yàn)科研價(jià)值的同時(shí)，還可以節(jié)約人力、物力和時(shí)間成本。

在現(xiàn)實(shí)案例中利用微衛(wèi)星進(jìn)行個(gè)體識(shí)別時(shí)，主要運(yùn)用的識(shí)別參數(shù)是聯(lián)合P(ID)值，它表示同一種群中任意兩個(gè)個(gè)體在多個(gè)微衛(wèi)星座位上具有一致基因型的概率，只有P(ID)值足夠?。≒(ID)＜0.001），才能準(zhǔn)確地運(yùn)用到個(gè)體識(shí)別中。隨著微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)的增加，P(ID)值也會(huì)隨著減少，但并不是位點(diǎn)數(shù)越多越好。一方面要考慮經(jīng)濟(jì)成本，另一方面，隨著位點(diǎn)數(shù)的增多，觀察到的基因分型錯(cuò)誤率也會(huì)上升。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，按照微衛(wèi)星位點(diǎn)的PI值由低到高增加時(shí)，當(dāng)微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)目達(dá)到5對(duì)時(shí)，矯正基因型的相似概率為0.00005608＜0.001，當(dāng)微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)目達(dá)到8對(duì)時(shí)，雙胞胎基因型的相似概率為0.000798＜0.001，因此，微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)的選擇可根據(jù)理論期望P(ID)值和同胞個(gè)體的P(ID)值來確定上下限。

另外，微衛(wèi)星位點(diǎn)若偏離了Hardy-Weinberg平衡也會(huì)造成P(ID)值的高估，本次研究中用Genepop 4.2.1評(píng)估了12個(gè)位點(diǎn)在進(jìn)行個(gè)體識(shí)別的紫貂群體中的哈溫平衡，結(jié)果顯示所有位點(diǎn)都沒有偏離Hardy-Weinberg平衡[4]。