申一凡，黃凱悅，任亞哲，陳婷，陸昌瑞，施宇，張云龍

（東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

Birt-Hogg-Dube′（BHD）綜合征是一種常染色體單基因顯性遺傳病，由于FLCN基因缺失或突變引起。1970年，加拿大醫(yī)生Birt、Hogg和Dube發(fā)現(xiàn)其臨床表現(xiàn)為細(xì)胞纖維瘤、腎囊腫、肺囊腫[1-3]。利用基因連鎖分析發(fā)現(xiàn)BHD綜合征是由FLCN基因突變和缺失引起的[4]。通過動物模型實驗發(fā)現(xiàn)FLCN雙基因敲除致死，而單基因敲除導(dǎo)致腎囊腫的產(chǎn)生[5-6]。目前的研究證實了FLCN作為腫瘤抑制因子在人體中發(fā)揮重要的作用，但FLCN誘發(fā)腫瘤的機制尚不明確。

FLCN蛋白具有高度保守性，并與目前已知的蛋白不具有同源性[7-8]。目前，F(xiàn)LCN的結(jié)構(gòu)與功能的研究還處于起步階段。Nookala R.K.通過X射線衍射技術(shù)解析了FLCN的C端（341～566）的結(jié)構(gòu)，推測其具有鳥苷酸交換因子的功能，但尚未得到明確的功能驗證實驗證據(jù)[9]。FLCN的N端結(jié)構(gòu)域及全長的結(jié)構(gòu)和功能更是未知。目前已知FLCN通過mTOR、TGF-β、自噬等細(xì)胞增殖與發(fā)育信號通路中都發(fā)揮著重要的作用[10-11]，但具體分子機制還存在一定缺陷。為了更有效地揭示其結(jié)構(gòu)與功能，F(xiàn)LCN的結(jié)構(gòu)解析尤為重要，結(jié)構(gòu)的解析將為功能的分析奠定基礎(chǔ)。

本實驗通過pGEX-6p-1載體構(gòu)建GST-FLCN融合基因重組質(zhì)粒，通過Top10菌種擴增基因和BL21菌種表達蛋白。通過GST親和介質(zhì)、離子交換介質(zhì)純化獲取GST-FLCN融合蛋白，再用Xa因子蛋白酶切除GST標(biāo)簽，經(jīng)二次分子篩純化獲取高純度FLCN蛋白，從而為FLCN的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-6p-1載體、重組質(zhì)粒pET28a-FLCN，由實驗室提供；E.coli Top10、E.coli BL21，質(zhì)粒抽提試劑盒，膠回收試劑盒購自上海生工；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，購自NEB公司；GST親和介質(zhì)，購自常州天地人和公司；高壓細(xì)胞破碎儀JNBIOJN-3000，購自廣州聚能納米生物科技股份有限公司；其余試劑皆為分析純。

1.2 方法與步驟

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

優(yōu)化并構(gòu)建pGEX-6p-1-GST-FLCN重組質(zhì)粒，首先利用PCR擴增FLCN基因，模板為本實驗室重組質(zhì)粒pET28a-FLCN，上、下游引物委托上海生工公司合成，上游引物：5'-ATACATGGATCCAATGCCA TTGTTGCCCTGTGTC-3'；下游引物：5'-ATACATC TCGAGTTAATTACGAGATTCAGATGCG-3'。隨后，將PCR產(chǎn)物和pGEX-6p-1載體利用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ進行雙酶切，使用生工的膠回收試劑盒回收FLCN基因和載體，再在16 ℃下T4 DNA連接酶過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Top10感受態(tài)細(xì)胞后，委托上海生工進行測序鑒定。

1.2.2 表達純化GST-FLCN融合蛋白

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，于平板上37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆，加入LB培養(yǎng)基中37 ℃225 r/min培養(yǎng)至OD600=0.5左右，加入1 mmol/L的IPTG在16 ℃誘導(dǎo)表達。

將菌液4 000 r/min 4 ℃離心30 min，棄上清后在冰上加入預(yù)冷凋亡1 L菌液/20 mL bind buffer（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH=8.0）重懸沉淀。再加入終濃度1 mmol/L的PMSF蛋白酶抑制劑，使用細(xì)胞高壓破碎儀在4 ℃，1.3×105kPa的壓力下破碎細(xì)胞。將破碎后的菌液兩次12 000 r/min 4 ℃離心30 min。使用Wash Buffer（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L谷胱甘肽，pH=8.0）洗雜蛋白，使用Elusion Buffer（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L谷胱甘肽，pH=8.0）洗脫蛋白。將洗脫液濃縮收集。

1.2.3 Xa因子蛋白酶酶切

將純化好的GST-FLCN融合蛋白和1 μL的Xa因子蛋白酶加入Buffer（50 mmol/L Tris，1 mmol/L DTT，pH=8.0）中，4 ℃酶切過夜。將酶切后的蛋白通過GST介質(zhì)親和純化，收集穿出液。

1.2.4 FLCN蛋白的分子篩純化

將酶切后的FLCN融合蛋白通過分子篩進一步純化，以獲得更高純度的FLCN蛋白。FLCN蛋白的分子量為64 kDa，使用Superdex 75層析柱，在SCGp100蛋白層析系統(tǒng)下進行純化。使用Buffer（50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl）進行上樣、洗脫及純化。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析FLCN蛋白組成

在Uniprot官網(wǎng)上下載FLCN的蛋白序列，使用EditSeq軟件對蛋白序列進行分析，結(jié)果見圖1。如圖1a，發(fā)現(xiàn)FLCN蛋白中大部分蛋白為疏水性氨基酸，表明其水溶性不高，為此選用了GST標(biāo)簽增加其溶解性。在http://cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc網(wǎng)站上對FLCN進行糖基化位點預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其在494位點可能存在糖基化修飾。糖基化修飾有利于蛋白和細(xì)胞膜的接觸或結(jié)合，因而推測FLCN可能參與跨膜轉(zhuǎn)運。

圖1 FLCN蛋白生物信息學(xué)分析

2.2 FLCN重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pET28a-FLCN為模板，使用PCR擴增目的基因。使用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切將目的基因和載體，并用T4 DNA連接酶將FLCN連入pGEX-6p-1載體中。將構(gòu)建好FLCN重組質(zhì)粒與pGEX-6p-1電泳，檢測結(jié)果如圖2所示。在生工測序結(jié)果顯示構(gòu)建成功并且沒有基因突變。

圖2 FLCN重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果

2.3 GST-FLCN融合蛋白表達純化

將構(gòu)建的GST-FLCN質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導(dǎo)表達，將菌液高壓破碎獲得含有目的蛋白的溶液，隨后通過GST介質(zhì)純化GST-FLCN融合蛋白。使用Wash Buffer多次洗脫能將大部分雜蛋白洗去，但是還會有一些雜蛋白和目的蛋白混在一起，無法洗脫，如圖3所示。

圖3 GST-FLCN蛋白的表達純化檢測結(jié)果

2.4 GST-FLCN融合蛋白Xa因子蛋白酶酶切

在蛋白濃縮樣品中加入適量Xa因子蛋白酶，4 ℃靜止過夜酶切。將酶切樣品再通過GST介質(zhì)親和純化，得到FLCN蛋白。如圖4所示，Xa因子蛋白酶酶切后得到了FLCN蛋白。

2.5 分子篩純化FLCN蛋白

GST-FLCN經(jīng)過酶切后，得到的FLCN蛋白中還有一部分雜蛋白，為了獲得更高純度的FLCN蛋白，使用了分子篩進行進一步的純化。FLCN蛋白酶切后的分子量為64 kDa，所以選用Superdex 75層析柱，在SCGp100蛋白層析系統(tǒng)下進行純化。如圖5所示，通過SDS檢測，可以發(fā)現(xiàn)得到了純度較高的FLCN蛋白，其純度為90%左右。

圖4 GST-FLCN蛋白酶切檢測結(jié)果

圖5 FLCN蛋白分子篩純化結(jié)果

3 結(jié)論

FLCN蛋白作為腫瘤抑制因子，在細(xì)胞中影響了細(xì)胞的增殖與凋亡，在機體中發(fā)揮著重要的作用。但目前為止，對FLCN蛋白的研究還不深入，其在機體中的作用機制還不明確。

在本實驗中，以pGEX-6p-1作為載體，在原核體系中高表達FLCN蛋白，通過GST介質(zhì)親和純化，Xa因子蛋白酶酶切以及分子篩獲得的高純度的FLCN蛋白，為FLCN蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了基礎(chǔ)。