全銘沁，董惠忠，沙云菲，陳 磊*，陳玙捷，張薄博，許贛榮

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海 200082）

煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，是國家稅收的重要來源。煙葉按采收部位分為上部葉、中部葉、下部葉，其中中部葉品質(zhì)優(yōu)良，在煙草工業(yè)中大量使用。而上部葉和下部葉與優(yōu)等的中部葉相比，由于化學(xué)成分協(xié)調(diào)性差，因此使用率很低，被視為低次煙葉。上部煙葉包括上二棚葉和頂葉，共6～7片，占整株煙葉總量的30%～40%[1]。上部煙葉葉片較厚，結(jié)構(gòu)較為致密，成熟度不夠，而且蛋白質(zhì)等大分子及煙堿含量過高，還原糖含量及糖堿比過低，因而化學(xué)成分協(xié)調(diào)性較差，導(dǎo)致燃燒后存在煙氣濃度和勁頭偏大、刺激性大、雜氣重等缺點[2-4]，這些因素導(dǎo)致上部煙葉的利用率大大降低，造成煙葉資源的嚴(yán)重浪費。

近年來用于改善低次煙葉燃吸品質(zhì)的方法主要有化學(xué)添加法、生物酶法和微生物發(fā)酵法[5-7]。微生物發(fā)酵法是在煙葉上人工接種微生物，對煙葉進(jìn)行發(fā)酵[8]，是實現(xiàn)煙葉增香增質(zhì)的有效途徑之一，煙葉的發(fā)酵通常分為自然發(fā)酵和人工發(fā)酵兩種[9]。自然發(fā)酵是將煙葉處理過后經(jīng)過一段時間的自然陳化的發(fā)酵方法，雖然操作簡單，但發(fā)酵耗時較長，占用空間大，經(jīng)濟(jì)性較差。因此，近年來采用人為的控制外在條件進(jìn)行，接種相關(guān)的細(xì)菌或真菌促進(jìn)煙葉盡快發(fā)酵的研究日漸增多。李寧等[10-11]分別利用蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）Van35處理煙葉后，發(fā)現(xiàn)煙葉的煙堿、蛋白質(zhì)等明顯降低，同時可顯著增加煙香、降低刺激性、醇和煙氣，改善卷煙吸味。陳雨峰等[12]發(fā)現(xiàn)，用不同濃度芽孢桿菌液處理上部煙葉后，均可促進(jìn)煙葉淀粉降解，提高糖含量、糖堿比、氮堿比和香氣量。鄒曉等[13]比較多株食用菌對煙葉品質(zhì)改善的效果后，發(fā)現(xiàn)平菇（Pleurotus ostrea）的一株菌有較好的醇化效果對煙葉品質(zhì)改善顯著，能有效提升煙葉香氣量和豐富性。余玉莎等[14]以米根霉（Rhizopus oryzae）TZK-1對煙葉進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明，米根霉TZK-1發(fā)酵煙末能使煙葉中18種致香成分含量增加。與自然發(fā)酵相比，人工發(fā)酵時間較短，但發(fā)酵工藝較為復(fù)雜，吸食品質(zhì)比自然發(fā)酵稍差[15]。在此基礎(chǔ)上，有學(xué)者結(jié)合生物酶法和微生物發(fā)酵法的優(yōu)勢，利用酶制劑和微生物處理煙葉碎片廢棄物制備天然煙用香料，使煙用香料在香氣和口感上比對照有明顯的提高，增香效果明顯[16]。與目前常用的三種煙葉品質(zhì)改善方法相比，生物酶法和微生物發(fā)酵法結(jié)合的方法既可以彌補發(fā)酵液本身酶活不足的缺陷，又能將發(fā)酵液中所含煙草本身的風(fēng)味成分添加到煙草中，在有效降低低次煙葉中淀粉、蛋白質(zhì)等大分子成分含量的同時，使煙草的香氣質(zhì)和香氣量得到顯著提高。

本研究為降低上部煙葉中的淀粉和蛋白質(zhì)含量，提高燃吸品質(zhì)，分別采用不同產(chǎn)地及類別的上部煙葉作為培養(yǎng)液基質(zhì)采用黑曲霉（Aspergillus niger）進(jìn)行發(fā)酵，以發(fā)酵液中淀粉酶和蛋白酶活為綜合指標(biāo)，對煙葉添加量、接種量、初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件。并將發(fā)酵液與復(fù)合生物酶（含淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶等）共同作用于上部煙葉，測定作用后煙葉中淀粉和蛋白的降解率，并對燃吸效果進(jìn)行感官評吸。以期效緩解優(yōu)質(zhì)煙葉不足的狀況，節(jié)約資源，降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和煙葉

黑曲霉（Aspergillus niger）：中國普通微生物菌種保藏管理中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC），菌株編號分別為3.6942、3.3927、3.4309、3.7059，為方便使用，實驗室將其分別記為h1、h4、h5、v。福建B1F上部青煙葉、河南B1F上部煙葉、湖南B1F上部煙葉、貴州B1F上部煙葉、河南B2F上部煙葉、湖南B2F上部煙葉、貴州B2F上部煙葉：上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、濃硫酸、酪蛋白、可溶性淀粉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；低溫α-淀粉酶（酶活2 000 U/g）、中性蛋白酶（酶活2×105U/g）、果膠酶（酶活1×105U/g）、纖維素酶（酶活5×104U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉6 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，121℃高壓滅菌20 min。

煙葉液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：不同產(chǎn)地及等級的上部煙葉粉末（過40目篩）5～50 g/L（具體添加量由實驗優(yōu)化），添加蒸餾水分散均勻，121℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

H2-2型電熱恒溫振蕩水浴箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HYL-C3型組合式搖床培養(yǎng)箱：太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；AA3型連續(xù)流動化學(xué)分析儀：德國SEAL公司；TGL-16M型臺式高速離心機(jī)：湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Enspire 2300型酶標(biāo)儀：美國PerkinElmer公司；UV3000型紫外-可見光分光光度計：日本Hitachi公司；MB45紅外水分測定儀：美國OHAUS儀器有限公司；FAl004型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將保存的菌種黑曲霉（Aspergillus niger）菌株 h1、h4、h5和v分別接種于PDA斜面培養(yǎng)基，28℃條件下恒溫培養(yǎng)1 d，進(jìn)行活化。

1.3.2 種子液制備

將供試煙葉磨碎成煙末，過40目篩，按照1%的煙葉添加量，稱取2 g煙末加入500 mL三角瓶中，加水200 mL，121℃滅菌20min，冷卻。用移液槍向斜面試管中加入10mL無菌水，反復(fù)吹吸使黑曲霉孢子分散在無菌水中，吸取一定量的孢子懸液接種到種子培養(yǎng)基中，使初始孢子濃度達(dá)到109個/mL，160 r/min、30 ℃搖瓶發(fā)酵3 d，用于發(fā)酵瓶中的培養(yǎng)。

1.3.3 菌種篩選

按5%的煙葉添加量，稱取粉碎后（過40目篩）的10 g上部煙葉加入500 mL三角瓶中，加水200 mL，在121℃的條件下滅菌20 min，待充分冷卻后，接入上述4種黑曲霉種子液，160 r/min、30℃搖瓶培養(yǎng)6 d，過濾掉培養(yǎng)基中固體成分后，離心獲得黑曲霉發(fā)酵液，測定其中淀粉酶、蛋白酶的活力。選定綜合活性最高的菌株，進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。

1.3.4 分析檢測

酶活測定方法：淀粉酶活性測定參照文獻(xiàn)中對大曲液化力的檢測方法[17]，以1 h液化可溶性淀粉1 g為1個酶活力單位（1 U）；蛋白酶活性測定依照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》方法進(jìn)行[18]，以1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位（1 U）。

淀粉含量的測定參照文獻(xiàn)[19]；蛋白含量測定參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》方法[20]。

1.3.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

煙葉添加量：按照0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的煙葉添加量配制發(fā)酵培養(yǎng)基，pH為發(fā)酵液原始值（約為6），接種5%體積分?jǐn)?shù)種子液，160 r/min、30℃搖瓶培養(yǎng)6 d。發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)過濾離心獲得黑曲霉發(fā)酵液，測定發(fā)酵液的淀粉酶和蛋白酶的酶活力。

接種量：以上述最佳煙葉添加量配制培養(yǎng)基，按照1%、3%、5%、7%、9%的接種量接種，其他條件同上所述，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中淀粉酶和蛋白酶的酶活力。

初始pH值：以上述最佳煙葉添加量配制培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，并接種適當(dāng)體積種子液。其他條件同上所述，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中淀粉酶和蛋白酶的酶活力。

發(fā)酵溫度：培養(yǎng)基中煙葉添加量、pH及接種量由上述實驗確定，分別在26℃、28℃、30℃、32℃、34℃條件下，160 r/min搖床培養(yǎng)6 d。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中淀粉酶和蛋白酶的酶活力。

發(fā)酵時間：其他發(fā)酵條件由上述實驗確定，按照發(fā)酵時間為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d分別收集對應(yīng)時間的發(fā)酵液，過濾離心獲取上清液，測定發(fā)酵液中的淀粉酶和蛋白酶的酶活力。

1.3.6 發(fā)酵液與復(fù)合酶對上部煙葉品質(zhì)改善的條件

將發(fā)酵液以及發(fā)酵液作為緩沖液復(fù)配復(fù)合酶對上部煙葉進(jìn)行處理，并優(yōu)化處理條件，比較不同條件下上部煙葉品質(zhì)的改善效果。

煙葉的處理方法：陳化后的上部煙葉經(jīng)松散回潮、切絲、烘絲后，制得試驗用長度均勻的煙絲（水分約12.5%）。精確稱?。?0.00±0.02）g煙絲置于篩網(wǎng)，于65℃水浴箱中保溫回潮20 min。將回潮結(jié)束的煙絲平鋪于干凈的20 cm×16 cm陶瓷托盤，按照一定料水比將發(fā)酵液或發(fā)酵復(fù)合酶液均勻噴灑在煙絲上，以食品級密封袋密封好，于適當(dāng)溫度恒溫箱中酶解。反應(yīng)結(jié)束后，采用烘箱快速烘干至水分含量12.0%～12.5%，裝袋存放。將煙葉樣品磨成粉末后，測定其中的淀粉含量和蛋白質(zhì)含量。

在本實驗室前期進(jìn)行的生物酶法降低上部煙葉中淀粉和蛋白等大分子的實驗中，得到適于處理上部煙葉的商品復(fù)合酶配比為[21]：中性蛋白酶550 U/g煙葉，纖維素酶220U/g煙葉，果膠酶220U/g煙葉，低溫α-淀粉酶33U/g煙葉（為降低反應(yīng)溫度，提高反應(yīng)效率，采用低溫淀粉酶）。將此配方中所含復(fù)合酶量定義為1個復(fù)合酶活力單位（1U/g），并用于本研究的實驗中。其中果膠酶和纖維素酶的作用為適度降解煙葉細(xì)胞壁，使淀粉酶和蛋白酶可以更為充分地起到降解作用，在本研究的發(fā)酵條件優(yōu)化中未作為測定指標(biāo)。

分別考察含水量（即2mL、4mL、6 mL、8 mL）發(fā)酵液溶解1U/g煙葉復(fù)合酶，分別對應(yīng)煙絲含水量（20%、40%、60%、80%）、發(fā)酵液比例（即在20%含水量前提下，調(diào)整其中發(fā)酵液比例為25%、50%、100%）、復(fù)合酶濃度[在20%含水量前提下，等量發(fā)酵液和水作為緩沖液，對不同復(fù)合酶添加量（1 U/g煙葉、0.5 U/g煙葉、0.25 U/g煙葉）]、反應(yīng)溫度（30℃、40 ℃、50 ℃）及反應(yīng)時間（0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h）進(jìn)行優(yōu)化。

發(fā)酵培養(yǎng)基所用煙葉種類對上部煙葉品質(zhì)的影響：在前期發(fā)酵時，使用不同的煙葉粉末配制不同的發(fā)酵培養(yǎng)基。使用的7種煙葉如下：福建B1F青煙葉、河南B1F上部煙葉、湖南B1F上部煙葉、貴州B1F上部煙葉、河南B2F上部煙葉、湖南B2F上部煙葉、貴州B2F上部煙葉。發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)過濾離心取上清收集7種發(fā)酵液和滅菌后未接種的河南B2F培養(yǎng)液，將所得樣品按照上述條件對上部煙葉進(jìn)行處理，比較改善效果。

1.3.7 煙葉評吸方法

由煙草公司的評吸人員對部分處理過的煙絲進(jìn)行評吸，評吸方法參考煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YCT 138—1998《煙草及煙草制品感官評價方法》中的三點檢驗的方法進(jìn)行。每種樣品使用未處理的煙絲作為空白對照，兩支空白，一支樣品。通過評吸時的差別對樣品進(jìn)行打分。參與評價的感官質(zhì)量指標(biāo)為：香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、勁頭、刺激性、余味。對每一種質(zhì)量指標(biāo)打分，最后進(jìn)行比較總結(jié)。打分說明如下：雜氣分?jǐn)?shù)越高，說明雜氣量越少；勁頭分?jǐn)?shù)越高，說明勁頭越小；刺激性分?jǐn)?shù)越高，說明刺激性（鼻腔、喉部）越小。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均采用3次平行設(shè)計（n=3），試驗數(shù)據(jù)采用Sigma plot 12.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

選取實驗室保藏的4株黑曲霉菌種，分別以上部煙葉為培養(yǎng)基底物進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，篩選產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶活力較高的菌株。結(jié)果表1所示。

表1 黑曲霉液態(tài)發(fā)酵上部煙葉菌種篩選Table1 Screening of the strains ofAspergillus nigerin liquid state fermentation of the upper tobacco leaves

由表1可以看出，選用的4株黑曲霉菌株中，菌株v產(chǎn)淀粉酶酶活最高，酶活力為2.02 U/mL，而菌株h5產(chǎn)蛋白酶酶活最高，為1.88U/mL。因此，綜合兩種酶活的結(jié)果（兩種酶均具有較高酶活），選定黑曲霉h5菌株作為上部煙葉發(fā)酵菌株。

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基中最佳煙葉添加量的確定

通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的煙葉添加量，以提高發(fā)酵后培養(yǎng)液中淀粉酶和蛋白酶的酶活，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在測定煙葉添加量范圍內(nèi)（0.5%～5%），淀粉酶酶活先增大后降低，在煙葉添加量為3%時，淀粉酶酶活達(dá)到最高，為2.41 U/mL；而蛋白酶酶活呈現(xiàn)先增大后趨于穩(wěn)定，在煙葉添加量為4%時達(dá)到最高，為1.83 U/mL，蛋白酶酶活在煙葉添加量為3%和4%時無顯著差異（P＞0.05）。因此，綜合考慮兩種酶活的最大值，選取發(fā)酵液中煙葉添加量為3%。

圖1 不同煙葉添加量對培養(yǎng)液中淀粉酶和蛋白酶酶活的影響Fig.1 Effect of different tobacco addition on the activities of amylase and protease in culture medium

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基最佳接種量的確定

種子液接種量對發(fā)酵后培養(yǎng)液中淀粉酶、蛋白酶酶活的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，接種量對淀粉酶的酶活影響不大，但對蛋白酶的酶活影響較為顯著，兩種酶的酶活均是隨接種量的增大而緩慢上升，在接種量為5%（V/V）時達(dá)到最大值，分別為2.69 U/mL和4.64 U/mL；接種量＞5%之后，蛋白酶酶活逐步降低。因此，發(fā)酵液中最佳接種量選定為5%。

圖2 不同接種量對培養(yǎng)液中淀粉酶和蛋白酶酶活的影響Fig.2 Effect of different inoculum on the activities of amylase and protease in culture medium

2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH的確定

不同初始pH對發(fā)酵液中淀粉酶和蛋白酶的酶活的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，兩種酶的酶活隨發(fā)酵液初始pH的增高均具有明顯的規(guī)律性，淀粉酶和蛋白酶酶活隨初始pH增高而逐漸增高，在初始pH=6.0時達(dá)到最大值，分別為2.66U/mL和9.74U/mL，之后隨pH升高而逐步降低，在初始pH 9.0時，蛋白酶酶活已檢測不到。因此，最佳發(fā)酵液初始pH值為6.0。

圖3 不同初始pH值對培養(yǎng)液中淀粉酶和蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effect of different initial pH on the activities of amylase and protease in culture medium

2.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基最佳發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對于微生物的生長具有十分重要的影響，發(fā)酵培養(yǎng)溫度對發(fā)酵液中淀粉酶和蛋白酶的酶活的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，發(fā)酵溫度對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)兩種酶的酶活影響是一致的，隨著發(fā)酵溫度的上升，兩種酶的酶活力的變化趨勢為先升高后降低，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時，兩種酶的酶活都達(dá)到最大值，分別為2.97U/mL和12.55U/mL。因此，最佳發(fā)酵溫度為30℃。

圖4 不同發(fā)酵溫度對培養(yǎng)液中淀粉酶和蛋白酶酶活的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperature on the activities of amylase and protease in culture medium

2.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基最佳發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間對發(fā)酵液中淀粉酶和蛋白酶的酶活的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，以煙草粉末為培養(yǎng)基底物接種黑曲霉發(fā)酵，淀粉酶酶活隨發(fā)酵時間的延長而提高，在第6天達(dá)到最大值3.42 U/mL，繼而逐步降低。蛋白酶酶活在發(fā)酵第2天出現(xiàn)一個較高值，繼而降低，并隨發(fā)酵時間延長而逐漸升高，第6天達(dá)到最高值12.73U/mL，之后酶活逐步降低。因此，確定最佳發(fā)酵時間為6 d。

綜合上述單因素優(yōu)化實驗可知，使用黑曲霉h5為發(fā)酵菌株液態(tài)發(fā)酵上部煙葉（河南B2F）粉末產(chǎn)復(fù)合酶，最優(yōu)產(chǎn)酶條件為煙葉添加量為3.0%、接種量5%、初始pH值為6.0、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間6 d。

圖5 不同發(fā)酵時間對培養(yǎng)液中淀粉酶和蛋白酶酶活的影響Fig.5 Effect of different fermentation time on the activities of amylase and protease in culture medium

2.3 發(fā)酵液-復(fù)合酶體系對上部煙葉吸食品質(zhì)的改善

前期研究表明，單純使用復(fù)合酶處理上部煙葉，可分別降低其中影響吸食品質(zhì)的淀粉和蛋白質(zhì)，使吸食品質(zhì)有一定提升，但仍存在香氣質(zhì)和香氣量偏低、雜氣較重等問題。預(yù)實驗結(jié)果表明，使用上部煙葉粉末作為培養(yǎng)基底物進(jìn)行黑曲霉發(fā)酵，將發(fā)酵液作為改良劑噴灑于上部煙絲，可顯著提升處理后煙絲的香氣質(zhì)和香氣量、降低雜氣、提升余味，但對勁頭和刺激性改善效果不明顯。因此，本研究結(jié)合兩者優(yōu)勢，以煙草發(fā)酵液作為緩沖液溶解復(fù)合酶（1U/g煙葉），配制復(fù)合改良劑，將其作用于上部煙絲，以淀粉和蛋白降解率為評價指標(biāo)，結(jié)合感官評吸，探討作用過程中的各類影響因素。

2.3.1 含水量對作用效果的影響

圖6 含水量對上部煙葉淀粉和蛋白降解率的影響Fig.6 Effect of water content on degradation rate of starch and protein in upper tobacco leaves

由圖6可知，隨煙葉中含水量的增加，復(fù)合改良劑對煙絲中淀粉和蛋白的降解率均呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢。在含水量為20%時，淀粉降解率最高，為24.39%；而蛋白質(zhì)降解率在含水量為80%時最高，為29.78%，但與含水量20%時（蛋白降解率為29.52%）并無顯著性差異（P＞0.05）。因在實際工業(yè)生產(chǎn)中煙葉含水量有嚴(yán)格要求，最高不得超過25%，因此，選擇最佳含水量為20%。

2.3.2 發(fā)酵液添加量對作用效果的影響

保持20%的煙絲含水量不變，調(diào)整復(fù)合改良劑中發(fā)酵液添加比例分別占總含水量的25%、50%和100%（以水補充不足體積）處理煙絲，結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著發(fā)酵液添加比例的提高，淀粉降解率顯著提高（P＜0.05），在發(fā)酵液添加量達(dá)到50%以后趨于穩(wěn)定。而發(fā)酵液添加比例對蛋白降解率影響不明顯，在實驗范圍內(nèi)，蛋白降解率約為29.50%。因此，選擇發(fā)酵液添加量為總含水量的50%為最佳的發(fā)酵液添加比例。

圖7 發(fā)酵液添加量對上部煙葉淀粉和蛋白降解率的影響Fig.7 Effect of fermentation broth addition on degradation rate of starch and protein in upper tobacco leaves

2.3.3 復(fù)合酶添加量對作用效果的影響

在上述所確定條件的基礎(chǔ)上，探討復(fù)合改良劑中所添加的復(fù)合酶量對上部煙葉品質(zhì)的改善效果，結(jié)果見圖8。由圖8可知，隨著復(fù)合酶添加量的增加，上部煙葉樣品中淀粉和蛋白降解率也隨之增加，分別由2.09%和20.78%增加至23.65%和30.41%。當(dāng)復(fù)合酶含量為1 U/g時，淀粉降解率最高為23.65%；蛋白的降解率最高為30.41%。由于前期研究結(jié)果顯示，在不添加發(fā)酵液的條件下，復(fù)合酶添加量＞1U/g之后，樣品的勁頭和刺激性有所增加，因此復(fù)合改良劑中復(fù)合酶添加量選定為1 U/g。

圖8 復(fù)合酶添加量對上部煙葉淀粉和蛋白降解率的影響Fig.8 Effect of compound enzyme addition on degradation rate of starch and protein in upper tobacco leaves

2.3.4 反應(yīng)溫度對作用效果的影響

反應(yīng)溫度對上部煙葉品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖9。由圖9可知，反應(yīng)溫度在30℃和40℃時，淀粉降解率沒有顯著性差異，約為23%，而上升至50℃時，淀粉降解率顯著下降（P＜0.05）。蛋白降解率則呈先上升后下降趨勢，在40℃時，蛋白降解率最高，為30.01%。淀粉和蛋白的降解率隨溫度變化的原因可能是，當(dāng)反應(yīng)溫度的較高時，作用于煙葉上的酶的活力降低，使得煙葉中的相應(yīng)化學(xué)成分的降解率也隨隨之降低。綜合考慮，選取40℃為復(fù)合改良劑的最佳反應(yīng)溫度。

圖9 反應(yīng)溫度對上部煙葉淀粉和蛋白降解率的影響Fig.9 Effect of reaction temperature on degradation rate of starch and protein in upper tobacco leaves

2.3.5 反應(yīng)時間對作用效果的影響

反應(yīng)時間對上部煙葉品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖10。由圖10可知，0.5～1.0 h作用時間時，淀粉降解率約為23%，無顯著差異（P＞0.05）；在反應(yīng)時間為2.0～3.0h時，淀粉降解率約為25%，作用時間繼續(xù)延長，則淀粉降解率下降。蛋白質(zhì)的降解效果則是隨著時反應(yīng)時間的增加呈下降趨勢。在反應(yīng)時間為0.5 h時，蛋白降解率最大為37.65%；在反應(yīng)時間＞2.0 h以后，蛋白質(zhì)降解率趨于穩(wěn)定。由此可得，使用復(fù)合改良劑作用于上部煙葉，其中淀粉的降解率在酶解時間為3.0 h時最好，蛋白降解效果在酶解時間為0.5 h時最好。由于淀粉和蛋白的降解率隨反應(yīng)時間的變化趨勢呈現(xiàn)較明顯的不一致，因此，安排感官評吸實驗，以評吸結(jié)果確定最佳反應(yīng)時間，結(jié)果見表2。

圖10 反應(yīng)時間對上部煙葉淀粉和蛋白降解率的影響Fig.10 Effect of reaction time on degradation rate of starch and protein in upper tobacco leaves

表2 反應(yīng)時間對河南B2F煙絲感官評吸的影響Table2 Effect of fermentation time on sensory evaluation of Henan B2F cut tobacco

由表2可知，反應(yīng)時間2.0 h和3.0 h時總分最高，煙氣濃度較高，加入發(fā)酵液后均會使整支煙的勁頭下降、雜氣量減少，同時煙氣在口腔中顯得圓潤，不暴躁，有一定的舒適感。而所有經(jīng)復(fù)合改良劑處理過的樣品香氣質(zhì)和香氣量均有所提升，并具有較好的余味。因此，選取反應(yīng)時間為2.0 h為最佳，此時，淀粉降解率為24.84%，蛋白降解率為21.22%。

2.4 不同煙葉發(fā)酵液作用效果的差異

為進(jìn)一步探討不同發(fā)酵液-復(fù)合酶組成的復(fù)合改良劑對上部煙葉吸食品質(zhì)的改善效果，使用不同類型、不同產(chǎn)地的煙葉作為底物進(jìn)行黑曲霉發(fā)酵，將所得發(fā)酵液-復(fù)合酶分別用于處理河南B2F煙葉，結(jié)果見圖11。

圖11 多種上部煙葉發(fā)酵液（含復(fù)合酶）對上部煙葉作用效果Fig.11 Effect of various upper tobacco leaves fermentation broth(with compound enzymes)on upper tobacco leaves

由圖11可知，噴灑在煙絲上的發(fā)酵液種類不同，淀粉降解率和蛋白降解率不同。其中以產(chǎn)自湖南的兩類上部煙葉粉末（湖南B1F和湖南B2F）作為培養(yǎng)液基質(zhì)進(jìn)行黑曲霉發(fā)酵，所得發(fā)酵液與復(fù)合酶的復(fù)合改良劑（即圖11中3和6）對淀粉和蛋白的降解率相對其他產(chǎn)地較高。湖南B1F發(fā)酵液與復(fù)合酶的復(fù)合改良劑對河南B2F上部煙葉中淀粉和蛋白降解效果最好，降解率分別為28.28%和28.83%。

對本實驗中所處理的煙葉進(jìn)行感官評吸，結(jié)果如表3所示。

表3 不同發(fā)酵液添加復(fù)合酶對河南B2F感官品質(zhì)的影響Table3 Effect of different fermentation broths with compound enzymes on sensory evaluation of Henan B2F

由表3可知，采用不同發(fā)酵液-復(fù)合酶的復(fù)合改良劑對河南B2F上部煙葉樣品均有較明顯的品質(zhì)提升，但青煙葉處理得到的樣品稍帶青雜氣，余味略苦澀，不適合于上部煙葉吸食品質(zhì)的改善。感官評價上湖南B1F上部煙葉發(fā)酵液整體效果最好，使樣品香氣質(zhì)、香氣量有明顯提高，同時雜氣下降明顯，有一定的舒適感，且余味較好，在該組樣品中為最優(yōu)。

2.5 湖南B1F發(fā)酵液-復(fù)合酶對不同上部煙葉的作用效果

為考察湖南B1F上部煙葉發(fā)酵液與復(fù)合酶的復(fù)合改良劑在其他煙葉中的適用性，將其作用于其他品種的上部煙葉，得到的感官評吸結(jié)果見表4。

表4 湖南B1F發(fā)酵液處理福建B2F和貴州B2F煙葉的感官評價結(jié)果Table4 Sensory evaluation results of Fujian B2F and Guizhou B2F tobacco treated with Hunan B1F fermentation broth

由表4可知，使用湖南B1F發(fā)酵液（含復(fù)合酶）處理過的福建B2F煙絲樣品的煙氣稍帶暴躁，雜氣未發(fā)生明顯變化，但香氣量飽滿，主要體現(xiàn)在福建B2F的枯焦氣和特征性酸感較舒適，加料之后的整體效果有一定提升。而由于貴州B2F煙葉幾乎沒有雜氣，對于使用湖南B1F發(fā)酵液（含復(fù)合酶）處理過的貴州B2F煙葉樣品，加料之后勁頭下降，雜氣并未發(fā)生變化，但煙氣濃度降低，舒適感增強，燃吸品質(zhì)改善明顯。

3 結(jié)論

本研究采用微生物發(fā)酵法結(jié)合生物酶法，以降低上部煙葉中的淀粉和蛋白質(zhì)含量，提升其燃吸品質(zhì)。首先篩選得到以上部煙葉粉末為液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基底物可以產(chǎn)較高淀粉酶和蛋白酶酶活的菌株黑曲霉h5，并對接種量、培養(yǎng)基中煙葉添加量、培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵溫度和時間等因素進(jìn)行優(yōu)化探索。將所得發(fā)酵液與生物酶配制成復(fù)合改良劑并作用于上部煙葉，結(jié)果顯示，在含水量20%、發(fā)酵液添加量50%、復(fù)合酶添加量1 U/g、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時間2 h的條件下，雖然淀粉和蛋白質(zhì)降解率并不是最高，但是具有相對較好的感官評價。進(jìn)一步對所用于發(fā)酵的煙葉底物進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，湖南B1F煙葉發(fā)酵液對上部煙葉燃吸品質(zhì)的改善效果更為顯著，并且在其他不同煙葉中均具有良好的改善效果。