李蕎蕎，王曙陽(yáng)*，董妙音，許富強(qiáng)，陳積紅，3，胡 偉，劉 敬，李文建，3

（1.中國(guó)科學(xué)院 近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049；3.甘肅省輻照誘變育種工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 武威 733001）

甜高粱作為飼用及糖料作物被長(zhǎng)期栽種，營(yíng)養(yǎng)豐富、生物產(chǎn)量高、用途廣泛、對(duì)生長(zhǎng)的環(huán)境條件不嚴(yán)格，是解決降低國(guó)際畜牧養(yǎng)殖成本的最佳飼料，也是緩解國(guó)際能源緊張的生物質(zhì)能[1]。青貯是保存和開(kāi)發(fā)飼料資源、發(fā)展“節(jié)糧型”畜牧業(yè)的有效手段[2]。青貯后的甜高粱酸甜適宜，牲畜喜歡采食，飼喂奶牛后產(chǎn)奶量增加[3]。添加乳酸菌能增加青貯早期乳酸菌的數(shù)量，迅速降低pH，從而抑制霉菌和其他細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，改善青貯發(fā)酵品質(zhì)[4]。添加同型乳酸菌可以快速增加乳酸含量，減少蛋白降解和氨基酸態(tài)氮的含量[5]，但同型菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸不足以抑制真菌的繁殖，青貯料開(kāi)封后，易引起二次發(fā)酵，導(dǎo)致有氧腐敗，而異型乳酸菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生乙酸，乙酸可以抑制真菌，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，結(jié)合二者的優(yōu)勢(shì)，添加同型菌和異型菌組成的復(fù)合菌劑，可以獲得最優(yōu)品質(zhì)的青貯飼料[6]。發(fā)酵品質(zhì)的評(píng)價(jià)主要是考察青貯飼料感官情況、營(yíng)養(yǎng)成分及發(fā)酵品質(zhì)[7-8]。

目前，飼用型甜高粱在國(guó)內(nèi)外大面積推廣種植，市場(chǎng)上青貯菌劑的種類(lèi)也日益增多，但國(guó)內(nèi)甜高粱青貯產(chǎn)業(yè)化研究和與開(kāi)發(fā)仍處在起始階段，針對(duì)甜高粱特性而開(kāi)發(fā)出的青貯菌劑較少，李俊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，甜高粱青貯成本高于玉米青貯，但飼喂效果優(yōu)于玉米青貯，董妙音等[2]研究發(fā)現(xiàn)，接種自制復(fù)合青貯菌劑FHI可提高甜高粱青貯品質(zhì)。因此，篩選研發(fā)適合甜高粱品種的添加劑，并優(yōu)化出最佳添加量，降低甜高梁青貯成本，對(duì)提高甜高粱青貯品質(zhì)及青貯產(chǎn)業(yè)化研究有重要意義。目前對(duì)于復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)甜高粱青貯最佳添加量的優(yōu)化試驗(yàn)鮮有報(bào)道，本研究通過(guò)測(cè)定分析5組不同添加劑量的自制復(fù)合乳酸菌劑以及美國(guó)、臺(tái)灣商品青貯菌劑對(duì)甜高梁秸稈青貯后的感官評(píng)價(jià)，營(yíng)養(yǎng)成分以及發(fā)酵品質(zhì)，綜合評(píng)價(jià)青貯質(zhì)量，以探討自制復(fù)合乳酸菌劑對(duì)甜高梁秸稈青貯的最佳添加量，為自制的青貯菌劑的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青貯原料：甜高梁秸稈，種植于甘肅省武威市近代物理研究所產(chǎn)業(yè)園，收割于2017年10月份。

菌劑：試驗(yàn)所用的乳酸菌復(fù)合菌劑由中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所微生物室制備，由Lact1、Lact2、Lact3、Lact4四種乳酸菌按1∶7∶1∶1的比例混合而成，其中Lact1、Lact2、Lact3、Lac4菌株分別為干酪乳桿菌、玉米乳桿菌、布氏乳桿菌、布氏乳桿菌，Lact1、Lact3是從甜高梁秸稈中分離，Lact2、Lac4是從玉米秸稈中分離，均是經(jīng)重離子輻照誘變篩選所得到的高產(chǎn)菌株。自制乳酸菌復(fù)合菌劑活性乳酸菌含量≥10億個(gè)/mL；美國(guó)青貯菌劑、臺(tái)灣青貯菌劑（由多種乳酸菌及酶組成，活性乳酸菌含量≥100億個(gè)/g）：臺(tái)灣亞芯生物科技有限公司。

葡萄糖：天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；牛肉膏：北京雙旋微生物培養(yǎng)基有限公司；蛋白胨：北京雙旋微生物培養(yǎng)基有限公司；酵母提取物：天津市光復(fù)精細(xì)化工廠(chǎng)；檸檬酸鈉：天津市北辰方正試劑廠(chǎng)；磷酸氫二鉀：天津市恒興化學(xué)試劑有限公司；乙酸鈉：天津市巴斯夫化工有限公司；吐溫-80：上海大眾制藥廠(chǎng)；硫酸鎂：天津市北辰方正試劑廠(chǎng)；硫酸錳：北京雙環(huán)化學(xué)試劑廠(chǎng)；以上試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10酸度計(jì)：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SP-756PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；2675高效液相色譜儀：WATERS公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；5417R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)Kendro公司；06粗纖維測(cè)定儀：濟(jì)南儀器盛泰有限公司；DL-1萬(wàn)用電爐：北京科偉永興儀器有限公司；ATN-100凱氏定氮儀：上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)方法

甜高粱秸稈人工剪碎至2 cm左右，控制青貯原料含水量為65%～75%，試驗(yàn)設(shè)8組，自制乳酸菌復(fù)合菌劑添加量0.5mL/kg組、1.0mL/kg組、1.5mL/kg組、2.0mL/kg組、2.5mL/kg組、美國(guó)組、臺(tái)灣組以及空白對(duì)照組（CK），自制復(fù)合菌劑按不同的添加劑量分別稀釋至20 mL，添加至100 g秸稈中，充分混合均勻后，裝填至聚乙烯真空包裝袋中，壓實(shí)，封口，空白對(duì)照組（CK處理）中噴等量的蒸餾水；美國(guó)（1加侖/100t）、臺(tái)灣商品菌劑組（20g/t）均按照商品的使用說(shuō)明加至秸稈中，美國(guó)、臺(tái)灣接種量分別為0.03785mL/kg、0.02g/kg。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共24袋，32℃青貯發(fā)酵17 d后，開(kāi)袋取樣檢測(cè)，對(duì)飼料進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，比較各組的青貯效果，以選出自制乳酸菌復(fù)合菌劑對(duì)甜高粱青貯的最佳添加量。

1.3.2 測(cè)定方法

（1）感官評(píng)價(jià)

根據(jù)農(nóng)業(yè)部頒布的《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，分別從pH值、水分、氣味、色澤、質(zhì)地等幾個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，分為優(yōu)、良、中、下四個(gè)等級(jí)[10]。評(píng)價(jià)得分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 青貯飼料品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table1 Quality evaluation standards of silage

（2）pH值的測(cè)定

開(kāi)袋取青貯鮮樣10 g于三角瓶中，加入90 mL蒸餾水，4℃冰箱靜置24h，依次用4層紗布和中性定性濾紙過(guò)濾，制得浸提液，采用精密pH計(jì)測(cè)定浸提液pH值[11]。

（3）主要微生物類(lèi)群數(shù)量分析

微生物數(shù)量采用平板記數(shù)法測(cè)定。取青貯鮮樣10g，加90mL滅菌生理鹽水，混合均勻后逐級(jí)稀釋至10-7，懸浮液平板涂布，測(cè)定乳酸菌、酵母菌及霉菌數(shù)量。乳酸菌采用MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，酵母菌和霉菌采用孟加拉紅培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3～5 d后計(jì)數(shù)[12]。

（4）青貯后營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

干物質(zhì)（dry matter，DM）含量的測(cè)定采用烘干法[13]；粗纖維、酸性洗滌纖維（aciddetergentfiber，ADF）和中性洗滌纖維（neutraldetergentfiber，NDF）的含量采用范氏（VanSoest）纖維測(cè)定法[14]；粗蛋白（crude protein，CP）和總氮含量GB 6432—1994《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》中的凱氏定氮法測(cè)定[15]；總糖采用GB 5009.9—2008《食品中淀粉的測(cè)定》中的斐林試劑熱滴定法測(cè)定[16]；采用高效液相色譜儀測(cè)定乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量[17]。

（5）青貯品質(zhì)評(píng)定方法

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》中，以氨基酸態(tài)氮、有機(jī)酸進(jìn)行綜合評(píng)定[8（]評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2～表3）。

表2 青貯飼料中氨基酸態(tài)氮與總氮比值評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table2 Evaluation standards for amino acid nitrogen to total nitrogen ratio in silage

表3 青貯飼料中有機(jī)酸含量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table3 Evaluation standards for organic acid content in silage

此評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)中，將pH值評(píng)分、有機(jī)酸評(píng)分和氨基酸態(tài)氮的評(píng)分相結(jié)合，pH值占25%，有機(jī)酸占50%，氨基酸態(tài)氮占25%，按比例相加得綜合得分[8]。綜合得分與青貯飼料質(zhì)量等級(jí)關(guān)系如表4所示。

表4 青貯飼料綜合得分與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量等級(jí)Table4 Comprehensive score of silage and corresponding quality grade

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)平行，采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同乳酸菌劑青貯后對(duì)青貯料感官評(píng)價(jià)的影響

青貯后，對(duì)不同乳酸菌添加劑處理的飼料進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，包括水分、pH值、干物質(zhì)、氣味、色澤、質(zhì)地，結(jié)果如表5所示。

表5 不同乳酸菌添加劑處理的青貯飼料感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table5 Sensory evaluation results of silage with different lactic acid bacteria additive

由表5可知，青貯發(fā)酵完成后，除美國(guó)組之外，青貯料的感官評(píng)價(jià)均優(yōu)于對(duì)照組。自制復(fù)合乳酸菌劑按不同的劑量添加于甜高梁中青貯后，感官評(píng)價(jià)均為優(yōu)等。復(fù)合菌劑各組pH較CK組均有降低，0.5 mL/kg組、2 mL/kg組以及1.5 mL/kg組pH較CK組顯著降低（P＜0.05），pH值分別比對(duì)照低了0.27、0.27、0.25；各組氣味均為不同程度的甘酸香味，無(wú)腐敗霉味，除CK組外，其他各組青貯料為黃色，說(shuō)明發(fā)酵良好。雖然感官評(píng)價(jià)能夠?qū)η噘A飼料品質(zhì)進(jìn)行快速直觀(guān)的判斷，但感官評(píng)價(jià)存在主觀(guān)性。因此，對(duì)青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。

2.2 不同乳酸菌添加劑對(duì)甜高粱青貯飼料微生物組成的影響

青貯發(fā)酵后，通過(guò)平板計(jì)數(shù)對(duì)飼料中微生物組成進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表6所示。

表6 不同乳酸菌添加劑對(duì)甜高粱青貯微生物組成的影響Table6 Effects of different lactic acid bacteria additive on microbial composition of sweet sorghum silage

青貯飼料中的乳酸菌數(shù)量越多，說(shuō)明青貯飼料品質(zhì)越好，而青貯飼料中的酵母菌、霉菌數(shù)量越多，說(shuō)明青貯飼料的品質(zhì)越差，并會(huì)引起青貯飼料的二次發(fā)酵[18]。由表6可知，乳酸菌添加劑可以影響甜高梁青貯飼料的微生物組成。青貯發(fā)酵后，乳酸菌數(shù)量均高于CK，以添加量1.5 mL/kg的處理最高，乳酸菌數(shù)量達(dá)到5×1010個(gè)/mL，顯著高于CK處理（P＜0.05）；除CK組外，其他組均未檢測(cè)到霉菌的存在，說(shuō)明發(fā)酵品質(zhì)良好；自制復(fù)合乳酸菌劑各添加量組均未檢測(cè)出酵母菌的存在，可能是由于自制混合乳酸菌劑中所存在的異型乳酸菌，發(fā)酵除產(chǎn)生乳酸外，還產(chǎn)生乙酸，抑制酵母菌和霉菌，從而提高青貯物的有氧穩(wěn)定性。說(shuō)明添加自制乳酸菌混合菌劑，有效抑制了酵母菌和霉菌的生長(zhǎng)，可以改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。

2.3 不同乳酸菌添加劑對(duì)甜高粱青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分的影響

青貯完成后取樣，測(cè)定甜高梁飼料的纖維、粗蛋白、總糖等指標(biāo)，分析不同乳酸菌添加劑對(duì)甜高粱青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分的影響，結(jié)果如表7所示。

由表7可知，甜高梁秸稈青貯完成后，干物質(zhì)含量較CK均存在顯著性差異（P＜0.05）。從粗蛋白含量來(lái)看，美國(guó)、臺(tái)灣、0.5 mL/kg組、1.0 mL/kg組、1.5 mL/kg組粗蛋白含量較CK組有顯著性差異（P＜0.05），1.5 mL/kg組處理的粗蛋白含量最高，較對(duì)照高出25.61%，較美國(guó)組、臺(tái)灣組提高了13.51%、8.91%；美國(guó)、臺(tái)灣、0.5 mL/kg組、1 mL/kg組分別較對(duì)照高出10.65%、15.33%、16.82%、24.30%。

表7 不同乳酸菌添加劑對(duì)甜高粱青貯營(yíng)養(yǎng)成分的影響Table7 Effects of different lactic acid bacteria additive on nutritional components of sweet sorghum silage

飼料中的中性和酸性洗滌纖維含量高會(huì)影響動(dòng)物的采食率和瘤胃消化率[19]。從酸性洗滌纖維含量來(lái)看，青貯后其含量較對(duì)照均有不同程度的降低，除2.5mL/kg組外，其他各組酸性洗滌纖維含量較對(duì)照均有顯著性差異（P＜0.05），1.5 mL/kg組含量最低，為37.09%，比對(duì)照降低了38.05%，較美國(guó)組、臺(tái)灣組分別降低了14.30%、26.09%；1 mL/kg組較對(duì)照降低了36.28%；美國(guó)、臺(tái)灣、2.0 mL/kg組分別比對(duì)照降低了27.69%、16.19%、29.33%。從中性洗滌纖維含量來(lái)看，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照相比均存在顯著性差異（P＜0.05），其中，美國(guó)組中性纖維含量最低，為71.37%，較對(duì)照低了10.60%；其他各組之間相差不大，1.5 mL/kg組、1.0 mL/kg組分別較對(duì)照低了7.28%、8.13%，2.5 mL/kg組、2.0 mL/kg組分別較對(duì)照低了5.60%、6.04%。

總糖是影響飼料青貯效果的一個(gè)重要因素，因此在適宜的條件下，總糖含量越高，發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌活動(dòng)更活躍[13]。從各處理組的總糖含量來(lái)看，在添加青貯菌劑青貯后，總糖含量的下降速率減緩，使得青貯飼料中的養(yǎng)分得以有效保存，從而提高了飼料的青貯品質(zhì)。添加量為1.5mL/kg組和0.5 mL/kg組的總糖含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），分別較對(duì)照高出18.18%、17.57%；1.5 mL/kg組總糖較美國(guó)組、臺(tái)灣組分別高出14.01%、6.81%。

2.4 不同乳酸菌添加劑對(duì)甜高粱青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

通過(guò)測(cè)定青貯后各組有機(jī)酸的含量及氨基酸態(tài)氮/總氮的比例，以分析不同乳酸菌添加劑對(duì)甜高粱青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響，結(jié)果如表8所示。

表8 乳酸菌添加劑對(duì)甜高粱青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響Table8 Effect of lactic acid bacteria additive on fermentation quality of sweet sorghum silage

由表8可知，從氨基酸態(tài)氮/總氮比值來(lái)看，添加菌劑組氨態(tài)氮/總氮比值均低于對(duì)照組。氨基酸態(tài)氮與總氮的比值是反應(yīng)青貯飼料中蛋白質(zhì)分解程度，比值越大，說(shuō)明青貯飼料中蛋白質(zhì)分解越多，青貯品質(zhì)越差[20]。實(shí)驗(yàn)組中添加量為1.5 mL/kg的處理組氨基酸態(tài)氮/總氮比值最低，為7.43%，比對(duì)照組低了2.67%，表明蛋白質(zhì)降解最少，說(shuō)明該處理組發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)于其他組；從有機(jī)酸的含量來(lái)看，乳酸、乙酸、丙酸的含量較對(duì)照均增加，各處理組均未檢測(cè)出丁酸的存在，丁酸由酪酸菌產(chǎn)生，可反應(yīng)青貯料的腐敗程度，丁酸越多，青貯飼料越腐敗。青貯質(zhì)量的優(yōu)劣取決于乳酸菌的作用，乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物是乳酸，因此乳酸的含量反映了青貯的質(zhì)量[21]。各處理組乳酸含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中1.5 mL/kg組乳酸含量最高，為9.34 g/kg，比對(duì)照高了177.15%，比美國(guó)組、臺(tái)灣組分別高出29.9%、31.18%；1.0mL/kg組乳酸含量較對(duì)照高了175.07%；0.5mL/kg組較對(duì)照高了153.11%；自制混合型乳酸菌劑中存在的異型乳酸菌Lac4發(fā)酵除生成乳酸外，還通過(guò)果膠聚糖單磷酸鹽途徑生成乙酸和二氧化碳，乙酸有很強(qiáng)的抗真菌功能，乙酸含量的提高會(huì)提高青貯物的有氧穩(wěn)定性。從發(fā)酵后乙酸的含量來(lái)看，實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，除2.0 mL/kg組外，其他各組乙酸含量與對(duì)照相比均存在顯著性差異（P＜0.05），其中，0.5 mL/kg組乙酸含量最高，為8.58 g/kg，比對(duì)照高了5.67g/kg；1.5mL/kg組次之，較對(duì)照高了3.77 g/kg；美國(guó)組、臺(tái)灣組分別比對(duì)照高了2.29 g/kg、2.06 g/kg。丙酸可抑制真菌繁殖，防止二次發(fā)酵，提高青貯的有氧穩(wěn)定性。從丙酸含量來(lái)看，實(shí)驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中，1.0 mL/kg組最高，為2.86g/kg；1.5 mL/kg組次之，為2.73 g/kg，分別比對(duì)照高了1.97 g/kg、1.84 g/kg；美國(guó)組和臺(tái)灣組分別較對(duì)照組高了1.41 g/kg、0.72 g/kg。

2.5 甜高粱青貯飼料質(zhì)量評(píng)價(jià)綜合得分

通過(guò)pH得分、氨基酸態(tài)氮/總氮得分、以及各有機(jī)酸所占比例的得分，綜合評(píng)價(jià)甜高梁青貯飼料質(zhì)量，結(jié)果如表9所示。

表9 甜高粱青貯飼料質(zhì)量評(píng)價(jià)綜合得分結(jié)果Table9 Comprehensive score results of quality evaluation of sweet sorghum silage

由表9的綜合評(píng)分可得，自制乳酸菌復(fù)合菌劑添加量為1.0 mL/kg、1.5 mL/kg、2.0 mL/kg時(shí)，青貯甜高梁質(zhì)量評(píng)價(jià)為優(yōu)等；0.5 mL/kg組、2.5 mL/kg組質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)為良好自制組評(píng)分均高于商品菌劑臺(tái)灣組和美國(guó)組。說(shuō)明自制乳酸菌復(fù)合菌劑可以提高甜高梁青貯品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)測(cè)定分析5組不同添加劑量的自制復(fù)合乳酸菌劑以及美國(guó)、臺(tái)灣商品青貯菌劑對(duì)甜高梁秸稈青貯后的感官評(píng)價(jià)，營(yíng)養(yǎng)成分以及發(fā)酵品質(zhì)，綜合評(píng)價(jià)青貯品質(zhì)，以探討自制復(fù)合乳酸菌劑對(duì)甜高梁秸稈青貯的最佳添加量。研究發(fā)現(xiàn)，添加量為1.5 mL/kg時(shí)，其乳酸含量比對(duì)照高了177.15%，比美國(guó)組、臺(tái)灣組分別高出29.9%、31.18%；粗蛋白含量較對(duì)照高了25.61%，總糖含量較對(duì)照高18.18%，比美國(guó)組、臺(tái)灣組分別高出14.01%、6.81%，綜合來(lái)看，1.5 mL/kg實(shí)驗(yàn)組甜高梁青貯品質(zhì)優(yōu)于美國(guó)、臺(tái)灣組，也優(yōu)于其他各劑量實(shí)驗(yàn)組，這對(duì)確定自制復(fù)合乳酸菌青貯菌劑的最佳添加量意義重大，對(duì)實(shí)驗(yàn)室自制青貯菌劑的推廣和應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。