陳勤怡，孫亞利，2，周文美，2*，周 敏，2，姜 瑩，2

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

《中國(guó)蕎麥品種資源目錄》中收錄的蕎麥資源共有2 795份[1]，蕎麥作為藥食同源性植物，同時(shí)兼有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值跟藥用價(jià)值[2-3]。蕎麥蛋白是蕎麥主要的生物活性成分[4]，并且氨基酸配比均衡[5]，蕎麥蛋白與小麥蛋白之間最大差異在于清蛋白和球蛋白的含量明顯高于醇溶蛋白和谷蛋白[6-8]。蕎麥淀粉的糊化特性[9]與小麥、大米和玉米相似[10-11]。研究表明，甜蕎直鏈淀粉含量為25.82%～32.67%，高于苦蕎淀粉（25.5%～26.5%）[12]。蕎麥淀粉具備耐消化淀粉特性，可作為糖尿病患者良好的補(bǔ)充食品[13-15]。蕎麥中含有9種脂肪酸[16]。對(duì)調(diào)節(jié)人體血壓、降低“三高”以及促進(jìn)酶的催化、預(yù)防心血管疾病等都有良好的作用[17]。

隨著蕎麥保健食品的開發(fā)與應(yīng)用[18]，蕎麥酒作為現(xiàn)代蕎麥開發(fā)的一項(xiàng)重要產(chǎn)品脫穎而出。有研究表明，蕎麥酒中不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、微量元素等基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)含有黃酮類物質(zhì)、有機(jī)酸及多酚類等多種特殊功能活性物質(zhì)[18]。具有降低人體血脂和膽固醇、軟化血管、保護(hù)視力和預(yù)防腦血管出血等作用[19]。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)發(fā)酵罐生產(chǎn)的蕎麥酒中蛋白質(zhì)，游離氨基酸、有機(jī)酸以及總多酚含量等營(yíng)養(yǎng)及活性成分進(jìn)行測(cè)定[20]，對(duì)蕎麥酒進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)[21]。旨在開發(fā)新型資源利用方式，改善傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，提高蕎麥中的營(yíng)養(yǎng)因子的利用率，制備風(fēng)味獨(dú)特的蕎麥酒[22]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蕎麥酒：實(shí)驗(yàn)室自制；黃酒（G-H）（五年）、黃酒（T-H）（五年）、黃酒（K-H）（五年）：市售；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液（WAKO）：日本和光藥業(yè)株式會(huì)社；福林酚（Folin-Ciocalteu）（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：貴州迪大生物科技有限公司；水楊酸（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；Tris（分析純）：Beijing Solarbic Science；抗壞血酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、乳糖（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白（分析純）：生工生物工程（上海）有限公司；高峰-α-淀粉酶（2 000 U/g）：源葉生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8800氨基酸自動(dòng)分析儀：HITACHI（日立）公司；GTR16-2高速冷凍離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；UV-2550紫外-可見光分光光度計(jì)：日本島津儀器公司；722s可見光分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；FA2004N分析天平：上海箐海儀器有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蕎麥酒的發(fā)酵罐制作工藝

操作要點(diǎn)：

粉碎：甜蕎與苦蕎粉碎，過40目篩，備用。

液化：按1∶2的比例稱取甜蕎與苦蕎粉，料液比為1∶4（g∶mL），調(diào)節(jié)pH至6.5，加入0.5%高峰-α-淀粉酶、在90 ℃條件下液化40 min。

糖化：冷卻液化后的樣品至室溫，糖化酶添加量為5%，調(diào)節(jié)pH至5.0，在60℃條件下糖化50 min后進(jìn)行滅菌。

發(fā)酵罐發(fā)酵：將滅菌后的樣品加入滅菌后的發(fā)酵罐內(nèi)，酵母添加量為0.6%，灌裝量在總體積的2/3左右，調(diào)節(jié)罐內(nèi)通氣量，設(shè)置轉(zhuǎn)速為100 r/min?？刂乒迌?nèi)溫度為31℃進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為7 d。

澄清：以殼聚糖添加量為0.6g/L，皂土添加量為0.2g/L，進(jìn)行澄清，澄清時(shí)間為2 d。

灌裝：將澄清部分的酒液進(jìn)行灌裝。

滅菌：在65～70℃條件下保溫12～15 min。

1.3.2 蕎麥酒中可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定[23]

采用考馬斯亮藍(lán)法，精確吸取0、0.02 mL、0.04 mL、0.06mL、0.08mL、0.10mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（1mg/mL）于6支10mL具塞試管中，分別加入0.10 mL、0.08 mL、0.06 mL、0.04 mL、0.02 mL、0 mL蒸餾水，再依次加入3 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，蓋塞、混合均勻，靜置2 min，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度值，以牛血清蛋白溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。

取經(jīng)稀釋20倍后的蕎麥酒樣品1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，設(shè)計(jì)三組平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其吸光度值并根據(jù)回歸方程計(jì)算出蕎麥酒中可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 蕎麥酒中游離氨基酸測(cè)定[24]

參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》中氨基酸測(cè)定方法，采用L-8800氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定，儀器進(jìn)樣時(shí)泵1的壓力為2～15 MPa，流速0.4 mL/min；泵2的壓力為0.5～2 MPa，流速0.35 mL/min。

1.3.4 蕎麥酒中總多酚含量測(cè)定[25]

分別精確吸取質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL、1.50 mL，用蒸餾水定容至25 mL，在波長(zhǎng)756 nm處測(cè)定吸光度值，以沒食子酸溶液質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確吸取蕎麥酒樣品1 mL，其他條件同建立沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算公式計(jì)算樣品中總多酚含量。

1.3.5 蕎麥酒中總黃酮含量測(cè)定

參照NYT1295—2007《蕎麥及其制品中總黃酮含量的測(cè)定》，測(cè)定樣品中總黃酮含量。

分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05mg/mL）0.025mL、0.50mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL置于10 mL容量瓶中，加入2 mL 0.1 mol/L三氯化鋁溶液、3 mL 1 mol/L乙酸鉀溶液，用甲醇定容，搖勻，室溫靜置30 min。在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 蕎麥酒中有機(jī)酸含量測(cè)定

參照GB/T15038—2006《葡萄酒，果酒通用試驗(yàn)方法》[26]，測(cè)定蕎麥酒中的部分有機(jī)酸含量，委托貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院（國(guó)家酒類及加工食品質(zhì)量監(jiān)控檢驗(yàn)中心）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥酒中可溶性蛋白質(zhì)含量

以蒸餾水為空白對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。得到線性回歸方程：Y=7.618 9x+0.017 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein

通過圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，在0～0.1 mg/mL范圍內(nèi)，牛血清蛋白溶液的質(zhì)量濃度與吸光度值之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。在波長(zhǎng)595 nm處分別測(cè)定3組處理酒樣的吸光度值，結(jié)果表明，蕎麥酒中可溶性蛋白質(zhì)含量為1.23 mg/mL。

2.2 蕎麥酒中游離氨基酸測(cè)定結(jié)果

2.2.1蕎麥酒中游離氨基酸含量及種類

游離氨基酸是液態(tài)法發(fā)酵蕎麥酒中重要的營(yíng)養(yǎng)成分，游離氨基酸含量與蕎麥酒的色、香、味、格都有一定關(guān)系。圖2為蕎麥酒中17種游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果，由圖2可知，蕎麥酒中包括7種人體必需氨基酸（纈氨酸（Val）300 mg/L、亮氨酸（Leu）280 mg/L、異亮氨酸（Ile）190 mg/L、蛋氨酸（Met）70 mg/L、苯丙氨酸（Phe）250 mg/L、蘇氨酸（Thr）340 mg/L、賴氨酸（Lys）570 mg/L），2種半必需氨基酸（組氨酸（His）220 mg/L、精氨酸（Arg）930 mg/L）以及8種非必需氨基酸。其中谷氨酸含量最高，占總氨基酸的23%，谷氨酸是人體內(nèi)一種重要的營(yíng)養(yǎng)成分，在治療精神分裂癥、神經(jīng)衰弱以及肝病方面都具有良好的療效。

圖2 蕎麥酒中游離氨基酸測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination results of free amino acids in buckwheat wine

2.2.2 蕎麥酒與其他黃酒中游離氨基酸含量對(duì)比

蕎麥酒與其他黃酒中游離氨基酸含量對(duì)比見表1。從表1可以看出，蕎麥酒中游離氨基酸的含量明顯高于三種市售黃酒產(chǎn)品，其中蕎麥酒中必需氨基酸約占總氨基酸的24.8%，G-H中必需氨基酸約占總氨基酸的32.9%，J-H中必須氨基酸約占總氨基酸的21.5%，蕎麥酒中的必需氨基酸所占總氨基酸比例介于G-H與J-H之間。蕎麥酒中含量最高的是谷氨酸1 860 mg/L，G-H黃酒中含量最高的是脯氨酸471.4 mg/L，T-H黃酒中含量最高的是精氨酸425.5 mg/L，J-H中含量最高的是丙氨酸166.536 mg/L。

表1 蕎麥酒與其他黃酒中游離氨基酸含量對(duì)比Table1 Comparison of free amino acids in buckwheat wine and other rice wines

續(xù)表

2.3蕎麥酒中總多酚含量測(cè)定結(jié)果與分析

2.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以蒸餾水空白組作為參比，以沒食子酸質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=5.014x+0.013 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4。表明沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與吸光度值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.2 蕎麥酒中總多酚含量測(cè)定

按上述最優(yōu)方法測(cè)定蕎麥酒中總多酚，平行6次試驗(yàn)測(cè)定，結(jié)果見表2。從表2可以看出，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.42%。蕎麥酒中總多酚含量為0.321 2 mg/mL。蕎麥酒中的多酚含量相對(duì)豐富且穩(wěn)定，使得蕎麥酒具有一定的抗氧化能力，多酚對(duì)動(dòng)物和人體內(nèi)的多種致病病毒的生長(zhǎng)都能產(chǎn)生明顯的抑制效果。對(duì)于人體軟骨組織的保護(hù)與預(yù)防骨質(zhì)疏松、保護(hù)眼睛視網(wǎng)膜、防止視力老化都有重要的作用，同時(shí)還具有抗菌、消炎等功效，因此蕎麥酒具備良好的保健功能。

表2 蕎麥酒多酚含量測(cè)定結(jié)果Table2 Determination results of polyphenol content in buckwheat wine

2.4 蕎麥酒中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果與分析

2.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=27.301x+0.000 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，在0～0.02 mg/mL范圍內(nèi)，蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度值之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。在波長(zhǎng)420 nm處分別測(cè)定3組處理酒樣的吸光度值，結(jié)果表明，蕎麥酒中總黃酮含量為0.122 6 mg/mL。

2.4.2 蕎麥酒中總黃酮含量的測(cè)定

按上述最優(yōu)方法測(cè)定蕎麥酒中總黃酮，平行6次試驗(yàn)測(cè)定，結(jié)果見表3。從表3可以看出，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89%。蕎麥酒中總黃酮含量為0.122 6 mg/mL，重現(xiàn)性良好，總黃酮含量穩(wěn)定。

表3 蕎麥酒總黃酮含量測(cè)定結(jié)果Table3 Determination results of total flavonoids in buckwheat wine

2.5 蕎麥酒中主要有機(jī)酸測(cè)定結(jié)果與分析

蕎麥酒的4種主要有機(jī)酸測(cè)定結(jié)果如表4所示，含量最高的是檸檬酸（1.62 g/L），其次是琥珀酸（0.65 g/L），同時(shí)還含有蘋果酸以及草酸（0.11g/L），蘋果酸具有抗疲勞、保護(hù)肝臟和增強(qiáng)心臟功能的功效。和傳統(tǒng)工藝的黃酒相比，蕎麥酒中草酸的含量和傳統(tǒng)的黃酒相當(dāng)，檸檬酸、草酸的含量相對(duì)豐富，而檸檬酸則具有延緩衰老，消除疲勞等功效，琥珀酸又是導(dǎo)致酒體回味的主要物質(zhì)，因此在多種有機(jī)酸的共同作用下，形成蕎麥酒獨(dú)有的風(fēng)味。

表4 蕎麥酒中主要有機(jī)酸測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination results of main organic acids in buckwheat wine

3 結(jié)論

本文分析了蕎麥酒酒體中可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸、有機(jī)酸、總多酚、總黃酮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，結(jié)果表明，發(fā)酵罐釀造蕎麥酒其營(yíng)養(yǎng)成分豐富，其中蕎麥酒可溶性蛋白含量為1.23 mg/mL，游離氨基酸總量達(dá)8 080 mg/mL，明顯高于市售酒G-H、T-H、K-H?？偠喾雍繛?.321 2 mg/mL；總黃酮含量為0.122 6 mg/mL；4種常見有機(jī)酸的含量分別為草酸0.11g/L、蘋果酸0.11g/L、檸檬酸1.62g/L，琥珀酸0.65g/L。

發(fā)酵罐液態(tài)發(fā)酵蕎麥酒使得水溶性營(yíng)養(yǎng)因子更多的保留在酒中，使其具有更好的保健價(jià)值，開拓了蕎麥資源的利用途徑，同時(shí)為蕎麥酒工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。