李騰宇，郭 艷，葛含靜，張 莉，王雙喜，吳 進，張 爽，李志西*

（1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西學前師范學院 生命科學與食品工程學院，陜西 西安 710061；3.西北農林科技大學 農學院，陜西 楊凌 712100）

紅糖也稱為黃糖、黑糖，是甘蔗汁用石灰法清凈處理后，直接煮成不經分蜜的棕紅色或黃褐色的食糖[1]。紅糖保留了甘蔗中大部分營養(yǎng)成分，含有多種人體必需氨基酸、有機酸和微量元素，還含有一些生理活性的物質，如多酚類化合物、植物甾醇、高級烷醇、葉綠素、礦物質、維生素等[2]。已有研究表明，紅糖中可提取出13種酚類物質，有較強的抗氧化活性[3]。傳統(tǒng)中醫(yī)學認為，紅糖性溫、味甘、入脾，具有益氣補血、健脾暖胃、緩中止痛、活血化瘀的作用。國外也有研究發(fā)現，紅糖有多種保健作用，如抗毒性、抗癌性，對高血壓和糖尿病有一定的預防作用[4]。目前，國內外對紅糖中活性物質及其生理功能方面的研究較多[5]，而對紅糖醋的開發(fā)及其功能性的研究較少[6-7]。本研究以紅糖為原料，經液態(tài)深層發(fā)酵法釀造紅糖醋，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析其不同發(fā)酵階段產物的有機酸組成，福林酚法和分光光度法檢測不同發(fā)酵階段產物的總多酚和總黃酮含量，測定其對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率和總還原力，分析紅糖醋不同發(fā)酵階段產物（紅糖液、紅糖酒醪和紅糖醋）有機酸組成、總多酚、總黃酮類含量及抗氧化活性的變化，探究發(fā)酵過程中總多酚、總黃酮與抗氧化關系，以期為紅糖液態(tài)醋的開發(fā)利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅糖：市售；香醋：石家莊珍極釀造集團有限責任公司；白醋：加加食品集團股份有限公司；酵母菌：安琪酵母股份有限公司；滬釀1.01醋酸菌：上海釀造一廠；草酸、酒石酸、甲酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀（均為色譜純）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；乳酸（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；抗壞血酸、氫氧化鈉、硝酸鈉、硝酸鋁（均為分析純）：廣州華大化學試劑有限公司；沒食子酸（分析純）：美國Aladdin公司；DPPH自由基：梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；蘆丁標準品（純度＞98%）：科邦生物科技有限公司；三氯乙酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AL104電子分析天平：梅特勒-托利多稱量儀器有限公司；WYT-4型手持糖量計：紹興市億納儀器制造有限公司；0-100酒精計：上海醫(yī)用儀表廠；752型可見分光分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HSY3-SP水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；H2050R型臺式離心機：湘儀離心機儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；水相針式過濾器（0.22 μm）：上海楚定分析儀器有限公司；150A型恒溫培養(yǎng)箱：天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅糖醋釀造工藝流程及操作要點

操作要點：12%的紅糖液，接種0.05%高活性酒用干酵母，攪拌均勻，在28℃恒溫箱內發(fā)酵，當酒精度達到6%vol以上且不再上升時，酒精發(fā)酵結束。在紅糖酒醪中接入活化的醋酸菌液（酒醪與菌液體積比10∶1），于（34±1）℃的條件下，采用實驗室小型自吸式發(fā)酵罐進行通氣發(fā)酵，當總酸含量達到5.0 g/100 mL時，醋酸發(fā)酵結束。

1.3.2 有機酸組分測定[8]

采用高效液相色譜法測定樣品中有機酸的含量，其色譜條件如下：Wondasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相，0.01 mol/L KH2PO4-H3PO4，緩沖溶液（pH 2.8）過0.22 μm水系濾膜；流速0.7 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。樣品處理：取一定量的樣品迅速高速冷凍離心（10 000 r/min、10 min），上清液用流動相稀釋10倍，過0.22 μm孔徑濾膜，濾液上機分析（進樣10 μL），用外標法定性定量。

1.3.3 總多酚含量的測定[9]

總多酚含量的測定采用福林酚法。以沒食子酸為標準品，沒食子酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制標準曲線。得標準曲線回歸方程為y=0.0034x+0.0210（R2=0.995 8）。準確稱取樣品0.1 mL，按照標準曲線回歸方程計算樣品中總多酚的含量。

1.3.4 總黃酮含量的測定[10]

總黃酮含量的測定采用比色法。以蘆丁為標準品，蘆丁質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制繪制蘆丁標準曲線。得標準曲線回歸方程為y=0.181 6x+0.003 4（R2=0.997 1）。按照標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮的含量。

1.3.5 DPPH自由基清除能力的測定

按照參考文獻[11]測定紅糖醋不同發(fā)酵階段產物的DPPH自由基清除能力。

1.3.6 總還原能力的測定

按照參考文獻[12]測定紅糖醋不同發(fā)酵階段產物的總還原能力。

1.3.7 統(tǒng)計分析

實驗數據重復3次，利用Origin 8.5進行作圖和統(tǒng)計，用SPSS 20數據處理軟件對實驗結果進行處理，結果用平均值±標準差表示，顯著性差異以不同字母表示（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 有機酸組成分析

按照1.3.1所述釀造工藝制得紅糖液、紅糖酒醪、紅糖醋。采用高效液相色譜法檢測其有機酸組分與含量，10種有機酸混合標樣高效液相色譜圖見圖1，紅糖液、紅糖酒醪、紅糖醋中有機酸組分測定高效液相色譜圖見圖2～圖4，含量結果見表1。

圖1 10種有機酸混合標樣高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 10 organic acids mixed standards

由圖1可看出，各有機酸標品分離效果較好，說明選擇的色譜條件適用。紅糖液、紅糖酒醪和紅糖醋有機酸組成不同。

由圖2可知，紅糖液含有草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、抗壞血酸、琥珀酸。由圖3可知，除紅糖液含有的8種有機酸外，紅糖酒醪還含有富馬酸。由圖4可知，紅糖醋含有10種有機酸，分別是草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、抗壞血酸、琥珀酸、酒石酸和富馬酸，酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵過程中有機酸的變化可能由于pH的降低和酵母代謝的產物的積累。

圖2 紅糖液中有機酸含量測定高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of organic acids contents in brown sugar liquid

圖3 紅糖酒醪中有機酸含量測定高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of organic acids contents in brown sugar alcoholic mash

圖4 紅糖醋中有機酸含量測定高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of organic acids contents in brown sugar vinegar

由表1可知，紅糖醋、紅糖酒醪及紅糖液分別檢出10種、9種及8種有機酸，主要為乙酸、乳酸、甲酸、抗壞血酸、琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸，紅糖液中琥珀酸和紅糖醋中乙酸含量較高，為4 971.09 mg/L和28 273.35 mg/L。在紅糖醋各發(fā)酵階段，變化最顯著的是乙酸、酒石酸，含量增加，而草酸、琥珀酸含量是降低的。此結果與向進樂等[8]對木瓜醋發(fā)酵階段有機酸變化的研究結果略有不同。紅糖發(fā)酵過程中乙酸含量呈上升趨勢，主要由于乙醇含量增加，進行氧化反應，酒精發(fā)酵階段發(fā)酵液氧氣含量較少，乙酸含量略有增加，醋酸發(fā)酵階段發(fā)酵液溶氧量大，乙酸含量顯著增加，最后達28 273.35 mg/L；同時又隨著發(fā)酵體系pH的不斷下降，酒石酸鹽溶解性增大[13]，表現出酒石酸質量濃度的顯著升高；而草酸在發(fā)酵初期質量濃度為577.64mg/L，紅糖酒醪階段降至394.98 mg/L，紅糖醋發(fā)酵階段最后降至240.23mg/L。主要由于草酸與發(fā)酵液中金屬離子結合成沉淀，草酸溶解度降低；琥珀酸的降低主要由于在無氧的條件下，酮戊二酸脫氫酶的缺失，琥珀酸由草酰乙酸到蘋果酸，部分還原為琥珀酸。有文獻報道[14]谷氨酸進入三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TAC）合成琥珀酸的，但在紅糖中甘氨酸含量很少，平衡趨向氧化方向進行，導致琥珀酸有下降。

表1 紅糖液、紅糖酒醪及紅糖醋的有機酸含量測定結果Table1 Determination results of organic acids contents in brown sugar liquid,brown sugar alcoholic mash and brown sugar vinegar mg/L

甲酸、蘋果酸、抗壞血酸是紅糖原料中主要的有機酸[15]，在紅糖醋各發(fā)酵階段發(fā)生階段性變化。甲酸表現為降低再增加的趨勢，主要由于酒精發(fā)酵階段甲酸部分降解或被酵母利用，但同時伴隨著甲醇產生[16]，在紅糖醋發(fā)酵階段甲醇氧化成了甲酸。蘋果酸表現為先升高再降低的趨勢，主要由于在酒精發(fā)酵階段琥珀酸部分轉化為蘋果酸，但在醋酸發(fā)酵階段由于醋酸菌的利用及氧化降解損耗了部分蘋果酸[17]。

富馬酸不是紅糖中的主要有機酸，是酵母在發(fā)酵過程中代謝產生的[18]，表現為酒精階段不斷積累，醋酸階段由于醋酸菌的利用或氧化降解而降低。而乳酸、檸檬酸在整個發(fā)酵過程相對穩(wěn)定，變化不顯著。

2.2 總多酚和總黃酮含量

不同樣品的總多酚和總黃酮類物質含量測定結果見表2。

表2 紅糖液、紅糖酒醪及紅糖醋中總多酚和總黃酮含量測定結果Table2 Determination results of total phenols and total flavonoids contents in brown sugar liquid,brown sugar alcoholic mash and brown sugar vinegar

由表2可知，紅糖在發(fā)酵過程中總多酚含量和總黃酮含量有下降趨勢，由紅糖液總多酚含量0.937 4 mg/mL降至紅糖醋0.867 1 mg/mL，總黃酮由紅糖液0.495 2 mg/mL降至紅糖醋的0.166 7 mg/mL，主要由于不穩(wěn)定的總多酚和總黃酮類物質在發(fā)酵過程中被氧化或降解[10]，但紅糖醋的總多酚和總黃酮含量遠遠高于香醋和白醋，表明相比于香醋和白醋，紅糖醋具有更豐富的酚類和黃酮類物質。

2.3 抗氧化能力

圖5 紅糖液、紅糖酒醪及紅糖醋的DPPH自由基清除能力（A）及總還原力（B）Fig.5 DPPH free radical scavenging ability(A)and the total reducing power(B)of brown sugar liquid,brown sugar alcoholic mash and brown sugar vinegar

由圖5A可知，不同發(fā)酵產物的DPPH自由基清除率隨著添加量的增加而不斷升高，當紅糖液添加量＞30 μL時DPPH清除率達到93.8%后趨于穩(wěn)定，紅糖酒醪、紅糖醋添加量＞40 μL之后，DPPH清除率分別達到92.99%、91.67%后趨于穩(wěn)定。由圖5B可知，總還原力變化趨勢與DPPH自由基清除率變化趨勢相同，隨著添加量的增加吸光度值不斷增加。樣品清除DPPH自由基能力與總還原力大小為紅糖液＞紅糖酒醪＞紅糖醋＞香醋＞白醋。

2.4 總多酚、總黃酮含量與抗氧化能力的關系

不同發(fā)酵階段樣品（紅糖液、紅糖酒醪及紅糖醋）總多酚含量（x1）、總黃酮（x2）含量分別與DPPH自由基清除率（y1）和總還原力（y2）的線性相關分析結果見圖6。

圖6 紅糖液、紅糖酒醪及紅糖醋的總多酚及總黃酮含量與DPPH清除率（A、B）和總還原力（C、D）關系Fig.6 Relationship between total phenols content or total flavonoids content and DPPH free radical scavenging ability(A,B)and the total reducing power(C,D)of brown sugar liquid,brown sugar alcoholic mash and brown sugar vinegar

由圖6可知，總多酚與DPPH自由基清除率的線性回歸方程為：y1=1.1197x1+0.0001，相關系數R2=0.8555，總黃酮與DPPH自由基清除率線性回歸方程為y1=5.961x2+11.171，相關系數R2=0.883 0。總多酚與總還原力線性回歸方程為y2=0.006 8x1+0.000 1，相關系數R2=0.907 8，總黃酮與總還原力線性回歸方程為y2=0.014 9x2+0.073 6，相關系數R2=0.909 3。總酚、總黃酮質量濃度均與DPPH自由基清除率和總還原力呈極顯著正相關性（P＜0.01），總多酚、總黃酮質量濃度越大，DPPH自由基清除率和總還原能力越強。結果表明，紅糖醋的DPPH自由基清除率和總還原力在很大程度上受總多酚和總黃酮含量的影響。此結論與張雪村等[19-20]研究紫甘薯醋及其不同發(fā)酵階段產物的抗氧化活性結果一致，紅糖醋的總多酚和總黃酮的含量遠高于對照液態(tài)發(fā)酵的香醋和白醋，所以紅糖醋表現出較強的抗氧化性。

3 結論

紅糖醋檢出10種有機酸，分別為草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、抗壞血酸、富馬酸、琥珀酸；紅糖醋在發(fā)酵過程中有機酸種類及含量變化主要表現為乙酸、酒石酸含量明顯增加，草酸、琥珀酸含量降低，甲酸含量先降低后升高，蘋果酸、富馬酸、抗壞血酸含量先升高后降低。在發(fā)酵過程中，總多酚和總黃酮含量由0.937 4 mg/mL和0.495 2 mg/mL降至0.867 1 mg/mL和0.166 7 mg/mL，主要由于部分總多酚和總黃酮類物質在醋酸發(fā)酵階段被氧化降解。紅糖醋不同發(fā)酵階段產物以及對照組液態(tài)發(fā)酵香醋和白醋抗氧化能力的關系為紅糖液＞紅糖酒醪＞紅糖醋＞香醋＞白醋，主要由于紅糖醋不同發(fā)酵階段產物的抗氧化能力與總多酚、總黃酮含量有很強的相關性。其中，總多酚、總黃酮含量與DPPH自由基清除率的相關系數分別為0.8555和0.8830，與總還原力的相關系數為0.9078和0.909 3。