孟卓妮，王 艷，吳鑫穎，王 嘯，邱樹毅*

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)試驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

酯化酶來源遍及動(dòng)物、植物和微生物，其中研究最早的是動(dòng)物酯化酶。但目前研究較多且常用的酯化酶大多數(shù)來源于微生物[1-2]。自然界能產(chǎn)酯化酶的微生物種類繁多，如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、鐮孢霉（Fusarium venenatum）、根霉（Rhizopus）、紅曲霉（Monascus sp.）、須霉（Phycomyces）、梨頭霉（Absidia）、青霉（Penicillium）、黃曲霉（Aspergillus flavus）等[3-10]。

紅曲霉是一種小型腐生絲狀真菌，在真菌分類學(xué)上屬于子囊菌亞門（Ascomycotina）、子囊菌綱（Ascomycetes）、真子囊菌亞綱（Euascomycetes）、曲霉科（Evrotiacene）、紅曲霉屬（Monascus）[11]。采用Ainsworth分類系統(tǒng)，紅曲霉屬于真菌界（Fungi）、真菌門（Eumycophyta）、子囊菌亞門（Ascomycotina）、不整囊菌綱（Pletomycetes）、散囊菌目（Eurotiales）、紅曲科（Monascaceae）[11]。按照Martin分類系統(tǒng)，紅曲霉屬于真菌門（Eumycophyta）、子囊菌綱（Ascomycetes）、真子囊菌亞綱（Euascomycetes）、曲霉目（Eurotiales）、曲霉科（Eurotiacene）[12]。

紅曲利用歷史悠久，可藥食兩用，是白酒中常用的產(chǎn)酯微生物。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，紅曲霉在發(fā)酵培養(yǎng)過程中能產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)[13-14]，主要有酯化酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、羧肽酶、蛋白酶、果膠酶、糖化酶、麥角固醇、紅曲色素、多糖、γ-氨基丁酸等。酯化酶又稱酯酶，屬于酯鍵水解酶類，能將酯水解成相應(yīng)的醇和酸，同時(shí)也可催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)和酯化反應(yīng)[15]。根據(jù)酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定酯化酶包含20種水解酶（編號(hào)EC3.1.1.1～EC3.1.1.20），其中研究較多的是脂肪酶[16]、羧酸酯酶[17-18]、膽固醇酯酶[19]、果膠酯酶[20]和膽堿酯酶[21]。

本課題組通過前期研究工作已對(duì)分離自貴州某濃香型酒廠中溫大曲的紫色紅曲霉（Monascuspurpureus）FBKL3.0018的培養(yǎng)周期、溫度、pH和液態(tài)培養(yǎng)基組分中碳源、氮源進(jìn)行了工藝優(yōu)化，該菌產(chǎn)酯化酶的酶活可達(dá)到348.57 U/mL。本試驗(yàn)以紫色紅曲霉FBKL3.0018為研究對(duì)象，研究添加不同營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)提高該菌株產(chǎn)酯化酶的影響，為其更好地產(chǎn)酯化酶提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018：篩選自貴州某濃香型酒廠的中溫大曲；硫酸鎂、無水氯化鈣、麥芽糖（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏（生化試劑）：北京奧博星責(zé)任有限公司；乳糖（分析純）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；D-半乳糖（純度≥98%）：上海朋索生化科技有限公司；伊利全脂、脫脂奶粉（食品級(jí)）：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；氨基酸（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司；α-乙酸萘酯、固藍(lán)B鹽（純度≥99%）、維生素（純度≥99%）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

菌種活化培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（maltextractagar，MEA）：環(huán)凱微生物科技有限公司。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40g/L，蛋白胨15g/L，MgSO·47H2O 1.5 g/L，pH自然，用蒸餾水配制，115℃濕熱滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏20 g/L，NaNO33 g/L，蔗糖60 g/L，無水CaCl22 g/L和MgSO·47H2O1.5 g/L，pH 4.5。

分別以葡萄糖50 g/L、蔗糖60 g/L、乳糖80 g/L、D-半乳糖7 g/L替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源（蔗糖60 g/L），其他條件不變，配制葡萄糖培養(yǎng)基、蔗糖培養(yǎng)基、乳糖培養(yǎng)基、半乳糖培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoFisher臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、MJX-250B-Z霉菌培養(yǎng)箱、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-98-11電子萬用電爐、101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；723型可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C pH酸度計(jì)：上海鴻蓋儀器有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市中大儀器廠；FA2004N電子天平：上海箐海儀器有限公司；ZQPL-200振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；JJ-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

將菌株FBKL3.0018接種到麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d后，用接種環(huán)刮至無菌生理鹽水中，在30℃、160 r/min條件下充分振蕩1 h，使游離菌株均勻分布在生理鹽水中。經(jīng)無菌脫脂棉過濾后，制成1×107～1×108個(gè)/mL的孢子懸液。按7%的接種量將孢子懸液接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在30℃、160r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)18h。再按9%的接種量將種子液再接種至裝有45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)96 h。

1.3.2 酯化酶活力測(cè)定方法

根據(jù)劉春紅等[22]的方法改進(jìn)如下：在0.25 mL用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇配制的0.006 mol/Lα-乙酸萘酯溶液中，依次加入4.25 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH6.5）、0.25 mL酶液，在40℃恒溫水浴10 min，分別加入0.25 mL 3%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）水溶液終止反應(yīng)，再分別加入0.25 mL 0.04%固藍(lán)B鹽溶液顯色劑，充分混勻計(jì)時(shí)30 s，最后分別加入0.25 mL 50%HCl后搖勻使顯色穩(wěn)定。以失活酶液代替原酶液作對(duì)照組，蒸餾水替代失活酶液其他不變作空白組，于波長(zhǎng)542 nm處測(cè)吸光度值。

酯化酶酶活力定義：40℃條件下反應(yīng)10 min，每分鐘產(chǎn)生1.0 μmolα-萘酚所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，U。酶活計(jì)算公式如下：

式中：X為酶活力，U/mL；ΔY542=Ytest-Ycontro（lYtest為樣品在波長(zhǎng)542 nm處的吸光度值，Ycontrol為對(duì)照組在波長(zhǎng)542 nm處的吸光度值）；n為發(fā)酵液稀釋倍數(shù)。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)添加劑的選擇

以發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照，分別考察在發(fā)酵培養(yǎng)基中不同維生素（維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素A、維生素C）及維生素添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%）；氨基酸（L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-酪氨酸、L-絲氨酸）及氨基酸添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%）、其他營(yíng)養(yǎng)元素（全脂奶粉、脫脂奶粉、乳糖和D-半乳糖）及其添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%）對(duì)菌株FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響。

（2）碳源對(duì)產(chǎn)酶與生物量積累的影響

將菌株FBKL3.0018分別置于蔗糖培養(yǎng)基、乳糖培養(yǎng)基和半乳糖培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過測(cè)定各培養(yǎng)條件下該菌酯化酶活力和相應(yīng)的生物量積累情況，研究該菌高產(chǎn)酯化酶與生物量積累量之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基中添加維生素的選擇

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，分別添加0.1%的不同維生素，檢測(cè)酯化酶的酶活，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同維生素對(duì)菌株FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響Fig.1 Effect of different vitamin on esterifying enzyme production by strain FBKL3.0018

由圖1可知，僅維生素C對(duì)產(chǎn)酯化酶起抑制作用，酯化酶酶活為208.32 U/mL，培養(yǎng)基中添加其他維生素均能促進(jìn)酯化酶生產(chǎn)。添加維生素B1和維生素A對(duì)產(chǎn)酯化酶的影響相似，且效果并不明顯，酯化酶酶活分別為348.59 U/mL和349.26 U/mL。添加維生素B2對(duì)酯化酶活性促進(jìn)效果最明顯，酯化酶酶活為395.81 U/mL，因此，選擇維生素B2繼續(xù)探究其促進(jìn)產(chǎn)酯化酶的最佳添加量。

不同維生素B2添加量對(duì)酯化酶酶活影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 維生素B2添加量對(duì)菌株FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響Fig.2 Effect of VB2addition on esterifying enzyme production by strain FBKL3.0018

由圖2可知，酯化酶酶活隨維生素B2添加量增加呈先增大后減小的趨勢(shì)。維生素B2添加量為0.05%～0.20%時(shí)，酯化酶酶活伴隨著維生素B2添加量的增加而增長(zhǎng)；維生素B2添加量為0.20%時(shí)，酯化酶酶活達(dá)到最大值為447.59 U/mL；當(dāng)維生素B2的添加量＞0.20%后，酯化酶酶活顯著下降。因此，選擇在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.20%維生素B2。

2.2 培養(yǎng)基中添加氨基酸的選擇

以初始發(fā)酵培養(yǎng)為對(duì)照，分別添加0.15%不同氨基酸，檢測(cè)酯化酶的酶活，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同氨基酸對(duì)菌株FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響Fig.3 Effect of different amino acid on esterifying enzyme production by strain FBKL3.0018

由圖3可知，除L-酪氨酸對(duì)產(chǎn)酯化酶起抑制作用外，培養(yǎng)基中添加其他氨基酸對(duì)酯化酶生成均具有一定促進(jìn)作用。L-賴氨酸及L-絲氨酸對(duì)酯化酶影響基本一致，且影響較?。惶砑覮-谷氨酸對(duì)酯化酶酶活促進(jìn)效果最明顯，酯化酶酶活為363.22 U/mL，因此，選擇L-谷氨酸繼續(xù)探究其促進(jìn)產(chǎn)酯化酶的最佳添加量。

不同L-谷氨酸添加量對(duì)酯化酶酶活影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 L-谷氨酸添加量對(duì)菌株FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響Fig.4 Effect of L-glutamate addition on esterifying enzyme production by strain FBKL3.0018

由圖4可知，酯化酶酶活隨L-谷氨酸添加量的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)L-谷氨酸添加量為0.05%～0.30%時(shí)，酯化酶酶活也逐步遞增；當(dāng)L-谷氨酸添加量為0.30%時(shí)，酯化酶酶活達(dá)到最大值為387.36 U/mL；當(dāng)L-谷氨酸添加量＞0.30%后，酯化酶酶活明顯下降。因此，選擇在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.30%L-谷氨酸。

2.3 培養(yǎng)基中添加其他營(yíng)養(yǎng)元素的選擇

以初始發(fā)酵培養(yǎng)為對(duì)照，分別添加0.5%不同營(yíng)養(yǎng)元素，檢測(cè)酯化酶的酶活，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，全脂奶粉、脫脂奶粉、乳糖和D-半乳糖均對(duì)產(chǎn)酯化酶起促進(jìn)作用，添加D-半乳糖對(duì)產(chǎn)酯化酶酶活促進(jìn)效果最明顯，酯化酶酶活為813.02 U/mL。其次是添加乳糖、脫脂奶粉、全脂奶粉，酯化酶酶活分別為684.12 U/mL、454.23 U/mL、396.66 U/mL，因此，選擇D-半乳糖繼續(xù)探究其促進(jìn)產(chǎn)酯化酶的最佳添加量。

圖5 其他營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)菌株FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響Fig.5 Effect of other nutrient elements on esterifying enzyme production by strain FBKL3.0018

不同D-半乳糖添加量對(duì)酯化酶酶活影響結(jié)果如圖6所示。

圖6 D-半乳糖添加量對(duì)菌株FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響Fig.6 Effect of D-galactose addition on esterifying enzyme production by strain FBKL3.0018

由圖6可知，酯化酶酶活隨D-半乳糖添加量的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)。D-半乳糖添加量為0.1%～0.7%時(shí)，酯化酶酶活隨D-半乳糖添加量的增加而增加；當(dāng)D-半乳糖添加量達(dá)到0.7%時(shí)，酯化酶酶活達(dá)到最大值為922.36 U/mL；當(dāng)D-半乳糖添加量＞0.7%后，酯化酶酶活開始降低。因此，選擇在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.7%D-半乳糖。

2.4 培養(yǎng)基碳源對(duì)產(chǎn)酶與生物量積累的影響

不同碳源培養(yǎng)基對(duì)菌株FBKL3.0018液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的影響及菌體的積累情況如圖7所示。

由圖7可知，D-半乳糖培養(yǎng)基對(duì)菌株FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶促進(jìn)效果最明顯，發(fā)酵36～144 h時(shí)，酯化酶酶活均遠(yuǎn)高于以蔗糖和乳糖為碳源發(fā)酵液酯化酶酶活，并在發(fā)酵至84 h時(shí)，酶活達(dá)最大值為919.12 U/mL；其次是乳糖培養(yǎng)基和蔗糖培養(yǎng)基在發(fā)酵108 h時(shí)，酯化酶酶活達(dá)到最大值，酶活分別為684.7 U/mL、434.2 U/mL。

圖7 不同碳源對(duì)菌株FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶（A）、生物量（B）的影響Fig.7 Effect of different carbon sources on esterifying enzyme production(A)and biomass(B)by strain FBKL3.0018

菌株FBKL3.0018在蔗糖培養(yǎng)基發(fā)酵36～144 h過程中生物量積累量均高于其他任何培養(yǎng)基，并在96 h時(shí)生物量積累達(dá)最大值為68.94mg/mL；乳糖培養(yǎng)基和D-半乳糖培養(yǎng)基在整個(gè)發(fā)酵過程中生物量積累量都比較少，生物量積累量分別為39.64 mg/mL（108 h）、43.22 mg/mL（84 h）。

3 結(jié)論

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.20%維生素B2、0.3%L-谷氨酸、0.7%D-半乳糖時(shí)，菌株FBKL3.0018所產(chǎn)酯化酶的酶活分別為447.59 U/mL、387.36 U/mL、922.36 U/mL，和對(duì)照組（348.57 U/mL）相比均有顯著提高。其中D-半乳糖非常明顯地促進(jìn)該菌生產(chǎn)代謝產(chǎn)物酯化酶。培養(yǎng)基碳源和酶活及生物量關(guān)系參數(shù)顯示，在以蔗糖、乳糖和D-半乳糖作為培養(yǎng)基碳源的條件下，D-半乳糖是促進(jìn)菌株產(chǎn)酯化酶的更合適的碳源，酯化酶酶活最大值為919.12 U/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他碳源，而蔗糖對(duì)酯化酶酶產(chǎn)量影響最小，但對(duì)紅曲霉生物量產(chǎn)量起積極作用，最大生物量為68.94 mg/mL。因此，酯化酶產(chǎn)量多少與其生物積累量并未有確切的關(guān)系，但有可能在今后根據(jù)菌特性在不同時(shí)間段加入不同碳源可獲得更高產(chǎn)量的酯化酶，而這還需要后續(xù)試驗(yàn)證實(shí)。