崔敬愛，邵智韜，戴碧瑋，徐 巖，莊若巖，陳曉平*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

黑曲霉（Aspergillus niger）是一種安全的應(yīng)用十分廣泛的工業(yè)菌種，不僅普遍性的被作為酶制劑，用于生產(chǎn)如葡萄糖淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶等酶，還被應(yīng)用于其他領(lǐng)域，如飼料制造業(yè)和畜牧養(yǎng)殖[1-4]。在農(nóng)業(yè)上還用來降解重金屬和大分子的有機(jī)物，改善土壤的結(jié)構(gòu)，在食品工業(yè)中，黑曲霉用于制造醋類、酒類、調(diào)味品等，由于黑曲霉出色的糖化能力，在釀酒米酒的過程中，黑曲霉可參與米酒曲的制作[5-8]。

黑曲霉及突變菌株是常見的糖化菌種，為了提高黑曲霉的工業(yè)價(jià)值，在工業(yè)中常對(duì)黑曲霉進(jìn)行誘變育種，誘變方法主要分為物理誘變和化學(xué)誘變。常見的物理誘變方式有紫外線、X-射線、γ-射線、離子束等，常見的化學(xué)誘變方式有烷化劑（如硫酸二乙酯）、核酸堿基類、抗生素等。

電子束輻照（electron beam irradiation，EBA）是20世紀(jì)90年代起開始被廣泛使用的技術(shù)，不同于傳統(tǒng)的γ-射線輻照原理，電子束輻照是經(jīng)高壓電場(chǎng)獲得的電子束射線，γ-射線屬于不帶電的電磁輻射，而由高能電子加速器產(chǎn)生的電子束是帶有負(fù)電荷的電子，輻射劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于γ-射線，能夠產(chǎn)生很大的突變譜[9-12]。電子直線加速器通過發(fā)射電子脈沖讓小分子物質(zhì)分解，從而產(chǎn)生活自由基，與核內(nèi)物質(zhì)作用，發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。近年來，國內(nèi)外對(duì)電子束輻射技術(shù)在食品領(lǐng)域的研究主要集中在殺菌保鮮方面，電子束輻照誘變領(lǐng)域的研究相對(duì)較少。電子束輻照誘變育種具有輻射損傷低、無污染源、誘發(fā)變異頻率高、突變譜廣等特點(diǎn)，是有著很大發(fā)展前景的新誘變?cè)碵13-16]。

糯米酒又稱醪糟、江米酒、甜酒，是中國重要的傳統(tǒng)發(fā)酵類食品之一，糯米酒的主要原料是糯米，搭配米酒曲和酵母菌等在多種微生物的作用下釀造而成，風(fēng)味酸甜醇香，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，酒精的含量相較于其他酒類少，深受廣大消費(fèi)者的喜愛[17-20]。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)，以黑曲霉原始菌株與電子束輻照誘變的突變菌株釀造的糯米酒作為檢測(cè)樣品，分別檢測(cè)其揮發(fā)性物質(zhì)，為黑曲霉的工業(yè)應(yīng)用糯米酒的開發(fā)與研究，以及電子束輻照誘變育種的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

糯米、麩皮：市售；黑曲霉（Aspergillusniger）CICC40099原始菌株：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（china center of industrial culture collection,CICC）；黑曲霉（Aspergillus niger）CICC40099突變菌株：本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)電子束輻照誘變育種后得到；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

氯化鈉（分析純）：無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；無水乙醇（色譜純）：珠海市香洲鵬達(dá)化工實(shí)業(yè)公司；C7～C40正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：美國o2si公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、察氏液體培養(yǎng)基：南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VF-PROACCEL-10-20電子直線加速器：山東藍(lán)孚高能物理技術(shù)股份有限公司；5975C安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；65-II磁力攪拌器：常州易晨儀器制造有限公司；LD-60KBS高壓滅菌鍋：蘇州奧普實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；2202C恒溫?fù)u床、DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海和呈設(shè)備有限公司；SPX-250Z型生化培養(yǎng)箱：成都領(lǐng)度儀器有限公司；HD-1360超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；GL-21LM高速冷凍離心機(jī)：青島洋洋裝備科技有限公司；DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；W919血球計(jì)數(shù)板：泰州為爾康醫(yī)用品有限公司；FWT-60劑量計(jì)：美國遠(yuǎn)西公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

（1）黑曲霉突變菌株的制備

在30℃條件下，黑曲霉CICC 40099置入察氏液體培養(yǎng)基中活化3 d后，接種到PDA固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d，用生理鹽水洗脫固體培養(yǎng)基表面孢子，180 r/min、30℃分散孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整黑曲霉孢子懸浮液濃度。電子束輻照在通化藍(lán)孚金匯電子加速器應(yīng)用有限公司進(jìn)行，電子直線加速器的額定功率是20 kW，電子束的能量是10 MeV，頻率是260 Hz，電子加速器下的傳動(dòng)鏈速度是1 m/min。輻照過程中使用劑量計(jì)進(jìn)行劑量追蹤，劑量計(jì)由中國計(jì)量科學(xué)研究院校準(zhǔn)。輻照劑量分別設(shè)置為0.1 kGy、0.2 kGy、0.3 kGy、0.4 kGy、0.5 kGy，電子束實(shí)測(cè)劑量分別為0.11 kGy、0.20 kGy、0.31 kGy、0.39 kGy、0.51 kGy。以上每個(gè)劑量三個(gè)平行，樣品輻射前后均貯藏于4℃冰箱中待測(cè)。

（2）原始菌株及突變菌株糖化酒曲的制備

30 g麩皮，30 mL無菌水，置入250 mL錐形瓶搖勻，在121℃高壓滅菌25 min，冷卻至30℃后，分別接種0.9 g黑曲霉原始菌株及突變菌株孢子粉，35℃條件下靜置培養(yǎng)3 d，即得到黑曲霉原始菌株及突變菌株糖化酒曲。

（3）糯米酒的制備

30℃條件下將糯米浸泡在無菌水中24h，水平面的高度超出糯米5 cm，100℃條件下糯米蒸煮30 min，冷卻至30℃后分別加入0.6%的原始菌株與突變菌株糖化曲，在30℃條件下糖化24 h，得到原始菌株與突變菌株的糖化液。稱取0.4%的釀酒酵母，在34℃的溫水中活化15 min后，分別加入兩種糖化液中，29℃發(fā)酵4 d，過濾澄清后，得到由原始菌株和突變菌株釀造的兩種成品糯米酒。

1.3.3 糖化酶酶活的分析

糖化酶酶活力定義：1 mL酶液，在40℃、pH 4.6的條件下，1h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖，為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）比色法測(cè)定糖化酶活力[21]。

1.3.4 米酒揮發(fā)性成分分析

樣品預(yù)處理：取兩種成品酒液置入離心管內(nèi)，13℃、12 000 r/min的條件下，離心10 min，去除雜質(zhì)，取上清液待測(cè)。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-624毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（He），載氣的流量為20.0mL/min，不分流進(jìn)樣。進(jìn)樣口溫度250℃，程序升溫：起始溫度60℃，保持時(shí)間3 min，以6℃/min的速率升至260℃，保持15 min，汽化室溫度260℃。進(jìn)樣方式為自動(dòng)進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，接口溫度為280℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流200 μA，離子源溫度250℃，四級(jí)桿的溫度150℃，傳輸線溫度250℃。質(zhì)量掃描范圍30～550 u，數(shù)據(jù)采集開始時(shí)間0 min。

定性定量分析：用Enhanceddataanalysis軟件完成數(shù)據(jù)處理，揮發(fā)物質(zhì)譜圖通過計(jì)算機(jī)與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和Wiley標(biāo)準(zhǔn)譜庫中進(jìn)行檢索匹配核對(duì)定性，采用峰面積歸一化法對(duì)樣品相對(duì)定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株誘變選育

2.1.1 電子束輻照誘變的結(jié)果

在額定功率為20 kW，電子束的能量為10 MeV，頻率為260 Hz，電子加速器下的傳動(dòng)鏈速度為1 m/min，輻射劑量分別為0.1kGy、0.2kGy、0.3kGy、0.4kGy、0.5kGy處理后，測(cè)得黑曲霉突變菌株的糖化酶活力，結(jié)果見表1。

表1 電子束輻照誘變菌株的酶活力檢測(cè)結(jié)果Table1 Determination results of enzyme activities of electron beam irradiation mutagenic strains

由表1可知，經(jīng)過電子束輻照誘變后，涂板篩選，對(duì)菌株進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)輻射劑量在0.2kGy時(shí)，菌株致死率在70%～90%之間，選取5株（命名為Y-1～Y-5），置于察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，經(jīng)多次篩選后，測(cè)得黑曲霉突變菌株Y-1～Y-5的糖化酶活力，結(jié)果見表2。

表2 突變菌株的篩選結(jié)果Table2 Screening results of the mutant strains

由表2可知，與原始菌株Y-0相比較，黑曲霉突變菌株Y-1～Y-5的糖化酶活力均有提高（77.28%～100.78%），其中黑曲霉突變菌株Y-3糖化酶活力最高，為1 366.5 U/mL。因此，進(jìn)一步考察菌株Y-3的遺傳穩(wěn)定性。

2.1.2 遺傳穩(wěn)定性研究

將突變菌株Y-3在察氏固體培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)5次，每次傳代后測(cè)定糖化酶活力，結(jié)果見表3。

表3 菌株Y-3遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)結(jié)果Table3 Determination results of genetic stability of strain Y-3

由表3可知，黑曲霉突變菌株Y-3在培養(yǎng)傳代5次之后，菌株的酶活力在一定程度上產(chǎn)生了變化，但是變化幅度微小，菌株的酶活力穩(wěn)定性良好。

2.2 原始菌株Y-0釀造的糯米酒風(fēng)味物質(zhì)分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)原始菌株Y-0釀造的糯米酒進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)分析，利用系統(tǒng)譜圖庫的檢索，對(duì)照相關(guān)文獻(xiàn)和查閱標(biāo)準(zhǔn)圖譜分析，使用峰面積歸一化方法確定了各組分的相對(duì)含量。總離子流色譜圖見圖1，原始菌株Y-0糯米酒的香氣成分分析結(jié)果見表4。

由表4可知，從原始菌株Y-0發(fā)酵糯米酒中共鑒定出了33種揮發(fā)性物質(zhì)，占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的95.864%，糯米酒的主要成分是醇類、酯類、酸類、醛類、酮類、硅氧烷類等。其中醇類物質(zhì)9種，共占總含量的70.121%，酯類物質(zhì)11種，共占總含量的13.590%，酮類物質(zhì)2種，共占總量的4.011%，醛類物質(zhì)3種，共占總量的4.522%，酸類物質(zhì)3種，共占總量的2.442%，硅氧烷類5種，共占總量的2.037%。在醇類物質(zhì)之中，乙醇的含量最多，占總量的49.956%。酯類中乙酸乙酯的含量最多，占總含量的10.719%。在糯米酒中，醇類和酯類組分所提供的香氣最為豐富，乙醇與苯乙醇為糯米酒提供了米酒的醇香氣味，苯乙醇帶有玫瑰香氣，乙酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯帶有獨(dú)特的花果香氣，辛酸乙酯提供了白蘭地酒的香氣，2,3-丁二酮和3-羥基-2-丁酮?jiǎng)t提供了牛奶與奶油的香氣。

圖1 原始菌株Y-0發(fā)酵糯米酒揮發(fā)性成分GC-MS分析的總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in glutinous rice wine fermented by original strain Y-0 with GC-MS

表4 原始菌株Y-0發(fā)酵糯米酒的香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table4 Analysis results of volatile components in glutinous rice wine fermented by original strain Y-0 with GC-MS

續(xù)表

2.3 突變菌株Y-3風(fēng)味物質(zhì)分析

使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)突變菌株Y-3釀造的糯米酒進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)分析，利用系統(tǒng)譜圖庫的檢索，對(duì)照相關(guān)文獻(xiàn)和查閱標(biāo)準(zhǔn)圖譜分析，使用峰面積歸一化法確定了各組分的相對(duì)含量?？傠x子流色譜圖見圖2，突變菌株Y-3發(fā)酵糯米酒的香氣成分分析結(jié)果見表5。

圖2 突變菌株Y-3發(fā)酵糯米酒揮發(fā)性成分GC-MS分析的總離子色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in glutinous rice wine fermented by the mutant strain Y-3 with GC-MS

由表5可知，從突變菌株Y-3發(fā)酵糯米酒中共分離出了33種揮發(fā)性物質(zhì)，占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的98.401%，其中醇類物質(zhì)9種，占總含量的67.350%，酯類物質(zhì)11種，占總含量的17.442%，酮類物質(zhì)2種，共占總量的4.350%，醛類物質(zhì)3種，共占總量的4.217%，酸類物質(zhì)3種，共占總量的2.63%，硅氧烷類4種，共占總量的1.412%。黑曲霉經(jīng)過電子束輻照誘變?cè)儆糜卺勗炫疵拙坪?，酒體的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生了變化。醇類物質(zhì)共減少了2.770%，其中乙醇含量增加了0.492%，苯乙醇的含量減少了1.535%。酯類物質(zhì)增加6.723%，其中乙酸乙酯增加了1.328%，乳酸乙酯增加了0.139%，己酸乙酯增加了1.243%，棕櫚酸乙酯增加了0.418%，氨茴酸甲酯增加了0.106%，辛酸乙酯增加了0.116%，乙酸苯乙酯增加了0.029%，癸酸乙酯增加了0.137%，十二酸乙酯增加了0.052%，十四酸乙酯增加了0.036%，亞油酸乙酯增加了0.246%。

表5 突變菌株Y-3發(fā)酵糯米酒的香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table5 Analysis results of volatile components in glutinous rice wine fermented by the mutant strain Y-3 with GC-MS

醇類與酯類是糯米酒風(fēng)味的主要來源，醇類物質(zhì)提供酒類的醇香氣味，酯類物質(zhì)則提供了花果的香氣和奶油蜂蜜的香氣。經(jīng)由電子束誘變的黑曲霉突變菌株代謝的機(jī)理與酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生了變化，導(dǎo)致其在糯米酒的釀造過程中酯類產(chǎn)物的產(chǎn)量增加，改變了糯米酒的風(fēng)味，酒類的香氣略微減弱，而花果香氣和奶香得到增長，使糯米酒產(chǎn)品更受消費(fèi)者的歡迎。

3 結(jié)論

糯米酒的風(fēng)味物質(zhì)中主要包含醇類、酯類、酸類、酮類和醛類物質(zhì)，其中最多的是醇類物質(zhì)，醇類物質(zhì)中以乙醇和苯乙醇的含量最多。酯類物質(zhì)檢測(cè)出11種，突變菌株糯米酒中的酯類物質(zhì)含量增加了6.723%，其中乙酸乙酯增加了1.328%，乳酸乙酯增加了0.139%，己酸乙酯增加了1.243%，棕櫚酸乙酯增加了0.418%，氨茴酸甲酯增加了0.106%，辛酸乙酯增加了0.116%，乙酸苯乙酯增加了0.029%，癸酸乙酯增加了0.137%，十二酸乙酯增加了0.052%，十四酸乙酯增加了0.036%，亞油酸乙酯增加了0.246%。能夠影響糯米酒風(fēng)味的揮發(fā)性物質(zhì)成分很多，除醇類和酯類以外，酸類、酮類等含量相對(duì)比較少的揮發(fā)性物質(zhì)也在改善酒體風(fēng)味上有著顯著的影響，其中酸類增加了0.180%，酮類增加了1.228%。

通過GC-MS檢測(cè)后，結(jié)果表明，在相同的釀酒條件下，使用經(jīng)電子束輻照誘變后的黑曲霉突變菌株釀酒，糯米酒的香氣成分發(fā)了變化，相較于原始菌株釀造的糯米酒，突變菌株糯米酒中的酯類物質(zhì)含量明顯增多，醇類物質(zhì)變化不明顯，酸類和酮類等主要風(fēng)味物質(zhì)略有增加，使得突變菌株糯米酒的酒體風(fēng)味更加濃郁，酒體香氣更加豐富宜人。