英士娟，陶怡曦，胡穎雄，楊 帆，段必成，王軍紅，李 云

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶三峽生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，重慶 400715；2.西南大學(xué)淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；3.三峽工程魚(yú)類資源保護(hù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)三峽集團(tuán)中華鱘研究所，湖北宜昌 443100)

由于長(zhǎng)江水利工程的建設(shè)和漁業(yè)資源的過(guò)度捕撈，長(zhǎng)江流域野生魚(yú)類數(shù)量急劇下降[1]。為緩解漁業(yè)資源下降的趨勢(shì)，我國(guó)廣泛開(kāi)展了水生生物增殖放流工作。但是人工養(yǎng)殖的魚(yú)苗或魚(yú)種投放到天然水體中，由于生存環(huán)境的改變，會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，極大地影響硬骨魚(yú)類的生理和行為[2]。應(yīng)激反應(yīng)具有兩面性，適當(dāng)應(yīng)激可以增加機(jī)體免疫力，過(guò)度應(yīng)激則會(huì)導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)超過(guò)機(jī)體自我調(diào)節(jié)閾值，打破了機(jī)體生理平衡，使機(jī)體免疫力降低甚至死亡[3-5]。因此，研究魚(yú)類放流后的生理適應(yīng)過(guò)程，對(duì)天然水域魚(yú)類資源增殖、養(yǎng)護(hù)具有重要指導(dǎo)意義。目前關(guān)于魚(yú)類增殖放流的效果評(píng)估報(bào)道主要集中在存活率和生長(zhǎng)速率方面[6-8]，曹偵等[9]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江流域放流的中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)約70天時(shí)生理狀況接近放流前水平，表明水生動(dòng)物對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)能力因種而異。

鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)是我國(guó)四大家魚(yú)之一，也是長(zhǎng)江增殖放流最主要的魚(yú)類，在三峽庫(kù)區(qū)天然水域放流濾食性鰱，既可保護(hù)其種質(zhì)資源，又能通過(guò)食物鏈吸納營(yíng)養(yǎng)鹽改善水質(zhì)[10]，因此，本研究以三峽水庫(kù)水域牧場(chǎng)放流鰱為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)測(cè)定其放流前后肝胰臟和血清生理生化指標(biāo)變化，了解鰱放流后對(duì)環(huán)境變化的生理適應(yīng)過(guò)程，對(duì)提高鰱增殖放流效果具有指導(dǎo)作用，也可為其他魚(yú)類的增殖養(yǎng)護(hù)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源及樣品采集

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)來(lái)自重慶市北碚區(qū)歇馬養(yǎng)殖場(chǎng)人工繁育的鰱大規(guī)格苗種。選取規(guī)格均一，健康無(wú)傷的鰱110尾，體長(zhǎng)為(28.63±1.91)cm，體重為(440.91±82.74)g。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2014年10月13日至2014年12月20日。放流前0天的鰱15尾作為對(duì)照組，在養(yǎng)殖場(chǎng)取樣。放流地點(diǎn)為重慶市三峽生態(tài)漁業(yè)股份有限公司所屬忠縣水域牧場(chǎng)，該場(chǎng)位于甘井河與長(zhǎng)江干流形成的河口庫(kù)灣，面積約400公頃，平均水深40 m，采用攔網(wǎng)的方式實(shí)施人工放養(yǎng)鰱、鳙魚(yú)種。為開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，在主河道建設(shè)了4個(gè)原位竹網(wǎng)箱，網(wǎng)箱規(guī)格為5 m×5 m×3 m。將110尾實(shí)驗(yàn)鰱平均放到4個(gè)網(wǎng)箱中。取樣時(shí)間為放流后第5、10、14、28、60和68天。每次取樣時(shí)測(cè)量水溫、溶解氧(DO)和pH等參數(shù)(表1)，并隨機(jī)抽取鰱15尾，取樣前用150 mg/L的MS-222麻醉實(shí)驗(yàn)魚(yú)，快速測(cè)量體長(zhǎng)、體重，然后置于解剖盤中迅速用一次性注射器從尾部靜脈端抽取血液2 mL，4 ℃靜置2 h，凝固后3 500 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液制備血清，放置于-80 ℃冰箱保存。同時(shí)解剖取其肝胰臟組織，經(jīng)超純水清洗后置于凍存管中于-80 ℃冰箱保存。

表1 鰱樣本和采樣水體條件參數(shù)Tab.1 The parameters of samples and water

1.2 指標(biāo)測(cè)定方法

選用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定放流前后鰱肝胰臟中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性，根據(jù)試劑盒操作步驟進(jìn)行測(cè)定。選用日本奧林巴斯Au 400全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、總膽紅素(TBIL)、總蛋白(TP)放流前后的活性或含量，根據(jù)儀器操作規(guī)范和配套試劑盒操作步驟進(jìn)行操作。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)的方式表示，用LSD檢驗(yàn)法和Dunnett’s檢驗(yàn)法進(jìn)行組間檢驗(yàn)，P<0.05則差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 放流后鰱血清乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的變化

放流后鰱血清的LDH、ALP、ALT 和AST 活性都呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)(表2)。在第5天均達(dá)到最高值，且都顯著高于放流前水平。LDH、ALP、ALT 和AST 最高值分別為(752.71±102.39)、(13.75±2.31)、(45.76±2.37)、(137.52±10.98) U/L，5 d后逐漸降低，分別在第10天后達(dá)到穩(wěn)定水平。

表2 放流后鰱血清中乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶和轉(zhuǎn)氨酶活性變化Tab.2 The activity changes of LDH， ALP， ALT， AST in H. molitrix after stocking

2.2 放流后鰱血清總蛋白、甘油三酯、總膽固醇和總膽紅素的變化

放流后鰱血清中TP、TG、TC 和TBIL 都出現(xiàn)了不同程度的先升高后下降的變化(表3)。其中TP 、TG和 TBIL在第5天達(dá)到了最高值，最高值分別為(26.53±0.37) g/L、(1.21±0.06) mmol/L和(2.00±0.09) μmol/L，TC 在第10天時(shí)達(dá)到了最高值(4.54±0.11) mmol/L，顯著高于放流前水平，5 d后活性逐漸下降。68 d時(shí)TP和TBIL恢復(fù)至原水平，但TG顯著低于放流前水平，TC顯著高于放流前水平。

表3 放流后鰱血清總蛋白、甘油三酯、總膽固醇和總膽紅素的變化Tab.3 The changes of TP， TG， TC， TBIL in H. molitrix after stocking

2.3 放流后鰱肝胰臟中抗氧化酶活性變化

放流后鰱肝胰臟中SOD 和CAT 都呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，在14 d時(shí)都達(dá)到了最高值，最高值分別為(10.13±0.09)、(88.90±17.77) U/mg prot，且均顯著高于放流前水平，之后逐漸降低，其中SOD 在68 d時(shí)恢復(fù)到原有水平，CAT 在60 d時(shí)與放流前無(wú)顯著差異，但略高于放流前水平(表4)。

表4 放流后鰱肝胰臟中抗氧化酶活性變化Tab.4 The changes of SOD and CAT in H. molitrix pancreas after stocking

3 討論

3.1 放流對(duì)鰱血清乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、轉(zhuǎn)氨酶活性和總膽紅素的影響

LDH是糖代謝中催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的酶，正常條件下血清LDH含量遠(yuǎn)低于組織中LDH含量[11]。ALP主要來(lái)源于肝胰臟，可催化磷酸單酯及磷酸核苷等類似化合物水解，同時(shí)還能參與體內(nèi)蛋白質(zhì)合成和脂質(zhì)代謝等[12]，可反映機(jī)體代謝程度，是肝胰臟損傷的重要指示酶。AST和ALT是肝胰臟代謝過(guò)程中指示肝胰臟損傷的重要酶，機(jī)體正常代謝環(huán)境下只有少量轉(zhuǎn)氨酶因細(xì)胞的不斷更新、破壞而釋放到血液中，血清中含量相對(duì)較低[13]。其活性高低可以判斷肝胰臟損傷程度，常作為機(jī)體肝損傷的指標(biāo)[14]。熱應(yīng)激下虹鱒血清中AST和ALT的活性升高，由此判斷熱應(yīng)激導(dǎo)致虹鱒肝胰臟損傷[4]。肝胰臟損傷時(shí)，細(xì)胞膜的通透性加大，使組織中LDH、ALP、AST和ALT釋放到血液中，血清LDH、ALP、AST和ALT的活性短時(shí)間內(nèi)急劇升高[15]，影響機(jī)體的正常代謝活動(dòng)。本研究中第5天鰱血清中LDH、ALP、AST和ALT均達(dá)到最高值，這可能是放流后受到環(huán)境因子的脅迫導(dǎo)致肝胰臟組織細(xì)胞受到損傷，影響了肝胰臟的正常生理功能，機(jī)體中脂質(zhì)過(guò)氧化物增多所致。隨時(shí)間的延長(zhǎng)其活性逐漸回降至原水平，表明放流鰱對(duì)環(huán)境快速適應(yīng)，肝胰臟損傷得以恢復(fù)。

TBIL是二甲川膽色素屬的一種膽汁色素，血液中含有直接型和間接型兩種膽紅素，前者主要來(lái)自肝細(xì)胞中非血紅蛋白血紅素的分解，后者主要來(lái)自紅細(xì)胞破壞降解或衰老的紅細(xì)胞崩解[16]。實(shí)驗(yàn)初期鰱體內(nèi)膽紅素的含量顯著升高，可能是由于放流后生理應(yīng)激，導(dǎo)致肝細(xì)胞異常，肝功能減退，肝胰臟中間接膽紅素轉(zhuǎn)化為直接膽紅素的能力減弱，同時(shí)直接膽紅素排泄受阻，不能完全排到膽道，使得血清中膽紅素的含量升高，這與斜帶石斑魚(yú)和虹鱒溫度脅迫后的TBIL變化趨勢(shì)一致[17-18]。實(shí)驗(yàn)后期總膽紅素的含量逐漸降低至放流前水平，說(shuō)明鰱的肝胰臟功能逐漸恢復(fù)。

3.2 放流對(duì)鰱血清總蛋白、甘油三酯和總膽固醇的影響

血清中的白蛋白和球蛋白合稱為TP，是組織蛋白合成的原料，反映機(jī)體蛋白代謝狀況，在魚(yú)的肝胰臟中合成，可修復(fù)機(jī)體組織，反映魚(yú)體的非特異性免疫水平的高低，還可作為能源物質(zhì)緊急供能，是衡量魚(yú)類應(yīng)激水平的指標(biāo)之一[19-20]。本研究中放流初期鰱血清TP的含量快速升高，放流后5 d達(dá)到峰值，其原因可能是放流初期對(duì)環(huán)境變化應(yīng)激反應(yīng)所致，之后顯著下降，28 d后趨于穩(wěn)定，表明放流魚(yú)類生理狀態(tài)逐漸趨于穩(wěn)定。

TG和TC是血脂的主要成分，參與機(jī)體基礎(chǔ)代謝。TG來(lái)自食物中的脂肪，肝胰臟也可以將某些糖類轉(zhuǎn)化為TG，是動(dòng)物脂肪的主要成分，是被儲(chǔ)藏的可迅速參與生命活動(dòng)的高效能源[17]，可反映機(jī)體肝代謝功能。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，會(huì)加強(qiáng)脂肪和肌肉組織的脂肪動(dòng)員和肝糖異生活動(dòng)，導(dǎo)致機(jī)體游離脂肪酸和血糖水平升高[21]，實(shí)驗(yàn)中鰱血清TG的含量在放流初期升高，說(shuō)明此時(shí)機(jī)體肝胰臟脂肪代謝受到顯著影響。在實(shí)驗(yàn)后期TG的含量逐漸下降并穩(wěn)定在較放流前稍低的水平，其原因一方面可能是鰱放流到天然水體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)后的回降，另一方面可能是鰱從放流前充足的人工投喂轉(zhuǎn)變到季節(jié)性水溫下降導(dǎo)致天然餌料不足而處于半饑餓狀態(tài)[22]，機(jī)體脂肪消耗減少所致。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中放流后鰱血清10 d內(nèi)TC的含量處于持續(xù)升高狀態(tài)，可能是由于氧化應(yīng)激反應(yīng)使肝胰臟損傷導(dǎo)致膽固醇的代謝途徑受阻，代謝物質(zhì)積累。10 d后TC含量逐漸回降，表明鰱肝胰臟功能逐漸恢復(fù)。

3.3 放流對(duì)鰱肝胰臟抗氧化酶活性的影響

任何生物體中均含有一定量自由基，其中活性氧(ROS)是生物體最重要的自由基，正常代謝過(guò)程中活性氧發(fā)揮著重要的生理作用，當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，ROS的數(shù)量大量增加，打破了機(jī)體ROS代謝平衡，對(duì)脂肪、蛋白質(zhì)和核酸等造成一定的損傷[23]。肝胰臟中CAT和SOD是直接參與分解體內(nèi)ROS的主要抗氧化酶。SOD可以將O2-歧化為H2O2和O2，而CAT可以將H2O2催化分解為H2O和O2。機(jī)體內(nèi)CAT和SOD的活性變化通常說(shuō)明機(jī)體內(nèi)積累了過(guò)量的ROS[24]。結(jié)果顯示，在鰱放流后，肝胰臟中SOD和CAT活性都有升高，在14 d時(shí)都達(dá)到了最高值，說(shuō)明放流初期機(jī)體產(chǎn)生大量的抗氧化酶以清除體內(nèi)過(guò)量的ROS，防御過(guò)氧化損害[25]。14 d后抗氧化酶活性逐漸回降，其中SOD在68 d時(shí)恢復(fù)到原有水平，CAT活性在60 d時(shí)與放流前無(wú)顯著差異，表明放流14 d后，隨著氧自由基的清除，環(huán)境脅迫效應(yīng)逐漸減弱，鰱逐漸適應(yīng)了新的環(huán)境。

4 結(jié)論

本研究測(cè)定了人工養(yǎng)殖鰱放流至天然水體后血清和肝胰臟生理生化指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，放流初期，由于環(huán)境變化，使鰱產(chǎn)生了較強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為放流后5 d反應(yīng)肝胰臟功能的血清酶活性和代謝指標(biāo)升高，表明肝胰臟組織應(yīng)激損傷，代謝加強(qiáng)應(yīng)對(duì)應(yīng)激所需，在5～14 d后各項(xiàng)指標(biāo)逐漸下降最后恢復(fù)到放流前水平或者達(dá)成新的穩(wěn)態(tài)。另一方面肝臟組織主要的抗氧化酶活力在放流后14 d升高到峰值，抗氧化能力增強(qiáng)以消除應(yīng)激產(chǎn)生的ROS，在60～68 d接近放流前水平。放流后68 d多數(shù)指標(biāo)已達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)或達(dá)到新的平衡，表明鰱從人工養(yǎng)殖環(huán)境轉(zhuǎn)換到 d然水域至少需要68 d的生理適應(yīng)期。以上研究結(jié)果對(duì)闡明放流鰱對(duì)天然水域的生理適應(yīng)過(guò)程提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，可為深入研究鰱對(duì)環(huán)境脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制提供參考。結(jié)果提示，對(duì)魚(yú)類放流前有必要進(jìn)行野化訓(xùn)練，放流后要進(jìn)行一段時(shí)間的監(jiān)管，以便其順利地渡過(guò)環(huán)境應(yīng)激適應(yīng)期，對(duì)提高魚(yú)類的野外存活率和放流效果具有重要意義。