李文德 張文斌* 華 軍 王治江

（1甘肅省張掖市經(jīng)濟(jì)作物推廣站，甘肅張掖7340001；2河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000）

灰樹(shù)花（Grifola frondosa）又名栗子菇，蓮花菌，舞茸等。隸屬擔(dān)子菌門，（Basidiomycota）傘菌亞門，（Agaricomycotina）傘菌綱，（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）薄孔菌科（Meripilaceae）樹(shù)花菌屬（Grifola），是一種食藥兩用的珍稀食用菌，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，此外還具有抗輻射功效[1-2]。香港大學(xué)張樹(shù)庭教授對(duì)其評(píng)價(jià)是“無(wú)葉無(wú)芽無(wú)花自身結(jié)果，可食可補(bǔ)可藥周身是寶”。據(jù)浙江醫(yī)科大學(xué)的黃幸紓教授等人的研究及臨床試驗(yàn)證實(shí)，從灰樹(shù)花的子實(shí)體、菌絲體及發(fā)酵濾液中提取的活性多糖均具有顯著地抗癌及免疫調(diào)節(jié)作用[3]。目前國(guó)內(nèi)已展開(kāi)了灰樹(shù)花栽培技術(shù)、生態(tài)特性與營(yíng)養(yǎng)分析等多方面的研究[4-7]，但有關(guān)灰樹(shù)花液體培養(yǎng)條件和胞外酶活性的研究卻報(bào)道不多。筆者研究了灰樹(shù)花在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)特性及4種胞外酶的活性變化，對(duì)加速灰樹(shù)花的制種速度，提高灰樹(shù)花產(chǎn)量，促進(jìn)農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展都具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

灰樹(shù)花2號(hào)，購(gòu)自北京吉蕈園科技有限公司。供試碳源為可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇，均為分析純。供試氮源為蛋白胨、酵母膏、硝酸鉀、硝酸銨、尿素，均為分析純。麩皮購(gòu)于張掖市市場(chǎng)。礦質(zhì)元素為硫酸銅、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、硫酸錳、硫酸鎂、硫酸鋅，均為分析純。

1.2 供試培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，瓊脂20 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，加水1000 mL。液體種培養(yǎng)基為不加瓊脂的母種培養(yǎng)基。碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基為母種培養(yǎng)基中葡萄糖用供試碳源代替。氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基為母種培養(yǎng)基中蛋白胨用供試氮源代替。礦質(zhì)元素基礎(chǔ)培養(yǎng)基為母種培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀、硫酸鎂用供試礦質(zhì)元素代替。初始pH基礎(chǔ)培養(yǎng)基為母種培養(yǎng)基，用10%的鹽酸和10%氫氧化鈉調(diào)至所需pH。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 液體菌種培養(yǎng)

將配制好的液體培養(yǎng)基分裝于三個(gè)250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，121℃下滅菌30 min，冷卻后接入已經(jīng)活化的斜面母種（0.5 cm×0.5 cm）5片，在25℃、110 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d。

1.3.2 不同碳源對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的影響

稱取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖、可溶性淀粉各20 g，分別加入1000 mL供試碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每一碳源處理培養(yǎng)液分裝于三個(gè)250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，經(jīng)滅菌后接入5%的液體菌種，在25℃、110 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。7 d之后測(cè)定菌絲生物量。

1.3.3 不同氮源對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的影響

稱取蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸銨、硝酸鉀、麩皮各4 g，分別溶于1000 mL供試氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每一種氮源處理培養(yǎng)液分裝于三個(gè)250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，接種、培養(yǎng)與測(cè)定同1.3.2。

1.3.4 不同礦質(zhì)元素對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的影響

稱取硫酸錳、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸亞鐵、硫酸銅、磷酸二氫鉀各0.5 g，分別溶于1000 mL礦質(zhì)元素基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，接種、培養(yǎng)與測(cè)定同1.3.2。

1.3.5 初始pH對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的影響

用10%的氫氧化鈉和10%的鹽酸及酸度計(jì)調(diào)基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH分別為2、4、6、8、10、12后分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL。每一處理三個(gè)重復(fù)，接種、培養(yǎng)與測(cè)定同1.3.2。

1.3.6 酶活性測(cè)定

粗酶液的制備：在250 mL的三角瓶中加入100 mL液體培養(yǎng)基并在每瓶中接入2%的液體菌種，在25℃、110 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后將菌液用四層紗布過(guò)濾，取濾液于10 mL離心管中，在5℃、4000 r/min條件下離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

淀粉酶活力的測(cè)定參照朱啟忠的方法［8］，羧甲基纖維素酶活力測(cè)定、鄰苯二酚氧化酶活性的測(cè)定參照馬桂珍的方法［9］，愈創(chuàng)木酚氧化酶活性的測(cè)定參照吳進(jìn)菊的方法［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1可知，不同碳源對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)均有影響，六種碳源培養(yǎng)基中葡萄糖為碳源的菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌絲干重為1.647 g/L，與乳糖、麥芽糖、甘露糖為碳源沒(méi)有差異，但與可溶性淀粉、蔗糖為碳源時(shí)差異達(dá)到顯著水平。蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度最慢，菌絲干重僅0.941 g/L，與葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基差異顯著，與其他碳源培養(yǎng)基沒(méi)有差異。

表1 不同碳源對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2 不同氮源對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2可知，不同氮源對(duì)灰樹(shù)花生長(zhǎng)速度均有影響，在硝酸銨作為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌絲干重為7.877 g/L，與其他氮源差異均達(dá)到顯著水平。在尿素為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度最慢，菌絲干重為1.064 g/L，與硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基差異達(dá)到極顯著水平，與其他氮源培養(yǎng)基沒(méi)有差異。

表2 不同氮源對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3 不同礦質(zhì)元素對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的影響

由表3可知，不同礦質(zhì)元素對(duì)灰樹(shù)花生長(zhǎng)均有影響。六種不同的礦質(zhì)元素培養(yǎng)基中，以磷酸二氫鉀培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌絲干重為0.672 g/L，與硫酸亞鐵培養(yǎng)基差異達(dá)到顯著水平，與硫酸錳培養(yǎng)基、硫酸銅培養(yǎng)基、硫酸鋅培養(yǎng)基、硫酸鎂培養(yǎng)基達(dá)到了極顯著差異水平。六種礦質(zhì)元素培養(yǎng)基中硫酸鎂培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)最慢的，菌絲干重為0.421 g/L，與磷酸二氫鉀培養(yǎng)基、硫酸亞鐵培養(yǎng)基達(dá)到極顯著水平，與硫酸錳培養(yǎng)基達(dá)到顯著水平，與其他兩種沒(méi)有差異。

表3 不同礦質(zhì)元素對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 不同初始pH對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的影響

圖1 不同初始pH對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的影響

圖2 鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶活性

由圖1可知，灰樹(shù)花在不同初始pH的培養(yǎng)基中，其生長(zhǎng)量不同。pH2、4時(shí)菌絲生物量最大，初始pH達(dá)4后菌絲生物量急劇降低，在pH大于6以后菌絲生物量變化不明顯，pH變化對(duì)其生長(zhǎng)影響不大。

2.5 灰樹(shù)花菌絲胞外酶活性測(cè)定

圖2、圖3結(jié)果表明，在整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)期間，淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶均有活性，且其酶活性高峰交替出現(xiàn)。其中鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶酶活性相似，均在46 h時(shí)出現(xiàn)第一次高峰，之后活性逐漸降低，但愈創(chuàng)木酚氧化酶在165 h后又小幅度上升，但二者總體呈下降趨勢(shì)。羧甲基纖維素酶也在46 h時(shí)出現(xiàn)第一次酶活性高峰，之后逐漸降低，在97 h時(shí)酶活性降到最低，之后隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)酶活性又逐漸上升，且在整個(gè)培養(yǎng)期羧甲基纖維素酶活性最高。淀粉酶的活性高峰則出現(xiàn)在培養(yǎng)后期，在整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中其活性波動(dòng)較大，雖然在前期會(huì)出現(xiàn)一個(gè)小的高峰（46 h），但之后仍呈下降趨勢(shì)，到97 h達(dá)到最低點(diǎn)，之后酶活性迅速上升，在117 h達(dá)到第二次高峰，但之后又緩慢下降，在143 h后又上升，但總體呈增強(qiáng)趨勢(shì)。在整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，灰樹(shù)花雖然在早期就開(kāi)始利用培養(yǎng)液中的糖類物質(zhì)、木屑纖維素及淀粉類物質(zhì)，而淀粉類物質(zhì)在后期利用更多。

3 小結(jié)與討論

不同碳源對(duì)灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)均有影響，最適碳源為葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖，灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)較好，菌絲干重較大；但從經(jīng)濟(jì)角度看，葡萄糖為其最適碳源；這一結(jié)果與前人研究相似[11]。所用灰樹(shù)花菌株的最佳氮源是硝酸銨，這一點(diǎn)與陳石良等人對(duì)灰樹(shù)花的研究結(jié)果不一致，其主要原因可能是灰樹(shù)花菌株之間存在差異[12]。試驗(yàn)表明灰樹(shù)花菌絲生長(zhǎng)的最佳礦質(zhì)元素是磷酸二氫鉀，這與張松等人的研究結(jié)果相同[13]?；覙?shù)花菌絲生長(zhǎng)的最適初始pH 2～4，由于沒(méi)有設(shè)計(jì)pH 0～2，其結(jié)果還有待進(jìn)一步研究。

圖3 淀粉酶、羧甲基纖維素酶活性

灰樹(shù)花在液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶這4種酶均有活性，表明灰樹(shù)花具有降解多糖類物質(zhì)和纖維素、木質(zhì)素的能力，這與倪新江等人的結(jié)論一致[14]。其淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶這4種酶的酶活性高峰期交替出現(xiàn)，具有明顯的活性變化。由于試驗(yàn)測(cè)定的時(shí)間較短，沒(méi)能更加完整的體現(xiàn)灰樹(shù)花培養(yǎng)期間酶活性變化的規(guī)律，有待今后進(jìn)一步研究。