陳建安，陳思玉，劉麗文，陳曉龍，朱威威，余 炎，何玉婷，孫冉冉，任志剛，李 娟，崔光瑩，余祖江

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052

膽囊癌(gallbladder cancer，GBC)是胃腸道系統(tǒng)中第七位高發(fā)的惡性腫瘤，同時(shí)也是膽道系統(tǒng)中最常見(jiàn)和最具侵襲性的腫瘤[1]。由于其早期無(wú)明顯癥狀，故診斷困難，加之易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，膽囊癌患者的5 a生存率低于5%[2-3]。到目前為止，外科手術(shù)切除仍是最有效的治療方法，但是大多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)失去了最佳手術(shù)時(shí)間[4]。因此，闡明GBC發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探索有效的預(yù)后生物分子標(biāo)志物，可能對(duì)膽囊癌的靶向治療有一定的作用。有研究[5]報(bào)道，腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)一種異常的糖代謝行為來(lái)躲避細(xì)胞凋亡程序，增強(qiáng)自身的增殖和侵襲能力，這種異常的糖代謝行為叫作Warburg效應(yīng)，是腫瘤得以發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。 丙酮酸激酶同工酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)是丙酮酸激酶的同種型之一，也是糖酵解的關(guān)鍵限速酶。近年來(lái)大量研究[6-8]證明PKM2與胃癌、舌癌和肝癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；且PKM2過(guò)表達(dá)與這些患者的預(yù)后不良有關(guān)，但PKM2在膽囊癌中的表達(dá)及作用鮮有報(bào)道。為此，作者進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株和主要試劑人膽囊癌GBC-SD和NOZ細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司，PKM2和GAPDH抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，PKM2 siRNA(序列為5’-CCAUAAUCGUCCUCACCAATT-3’)及陰性對(duì)照siRNA(序列為5’-CCAGUUUACCUAACGCAAUTT-3’)由上海吉瑪制藥公司設(shè)計(jì)合成，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司， MTT試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，Matrigel膠和Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司，DAB溶液購(gòu)自美國(guó)Boster公司，葡萄糖測(cè)試試劑盒購(gòu)自中國(guó)普利萊基因技術(shù)有限公司，ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cayman Chemical公司；乳酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2膽囊癌組織與癌旁正常組織中PKM2蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)收集2009年4月至2014年4月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院行膽囊癌手術(shù)切除患者的膽囊石蠟包埋組織，包括53例膽囊癌組織和27例癌旁正常組織。組織經(jīng)過(guò)脫苯脫蠟抗原修復(fù)等步驟，加兔抗人PKM2抗體(按1∶200稀釋)室溫孵育2 h，PBS洗片后加羊抗兔二抗室溫孵育1 h，用DAB溶液顯示信號(hào)。由兩名病理學(xué)家以雙盲法進(jìn)行閱片，在200倍顯微鏡下選取3個(gè)視野，參照Remmele評(píng)分系統(tǒng)[9]按染色區(qū)域百分比進(jìn)行評(píng)分：無(wú)染色為陰性(-)，<25%為+，25%～為，50%～為，>75%為。該研究得到了鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染GBC-SD和NOZ細(xì)胞復(fù)蘇后放在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分別收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GBC-SD和NOZ細(xì)胞接種于6孔板，用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染PKM2 siRNA、陰性對(duì)照siRNA，48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞增殖的MTT法檢測(cè)將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞以每孔5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板，培養(yǎng)1、2、3、4和5 d后分別加入5 g/L無(wú)菌MTT溶液20 μL。37 ℃孵育4 h后棄去上清繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩混勻，檢測(cè)490 nm處的吸光度值。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5細(xì)胞中PKM2表達(dá)的免疫熒光法檢測(cè)將GBC-SD和NOZ細(xì)胞以每孔2×105個(gè)/mL的密度接種于24孔板，孵育24 h后取出細(xì)胞爬片，待40 g/L多聚甲醛固定及體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清室溫孵育2 h后，加入體積分?jǐn)?shù)1% PBS稀釋的PKM2(按1∶50稀釋)并4 ℃搖床過(guò)夜。PBS洗3遍，加熒光二抗IgG室溫孵育1h。熒光顯微鏡下拍照，定位PKM2的表達(dá)。

1.6細(xì)胞中PKM2表達(dá)的Westernblot檢測(cè)用RIPA裂解蛋白提取試劑(碧云天生物技術(shù)有限公司)和蛋白酶抑制劑(美國(guó)羅氏公司)收集細(xì)胞和細(xì)胞裂解物，取等量的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含50 g/L脫脂乳和體積分?jǐn)?shù)0.1%吐溫20 TBS封閉1 h，分別加入PKM2一抗(按1∶1 000稀釋)、β-actin一抗(按1∶5 000稀釋)，4 ℃搖床過(guò)夜，TBST洗滌3次，經(jīng)二抗孵育1 h并洗滌后，將膜暴露。結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行分析。以目的蛋白和內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7細(xì)胞體外侵襲能力的Transwell小室檢測(cè)將50 μL Matrigel膠鋪在孔徑為8 μm的24孔Transwell小室的上室，37 ℃放置8 h。上室加入105個(gè)細(xì)胞，總體積200 μL，下室加入300 μL含血清培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，48 h后取出小室，甲醇固定并用結(jié)晶紫染色孵育10 min后，去除上層小室側(cè)的未遷移的細(xì)胞，觀察達(dá)到遷移杯底下面的細(xì)胞。顯微鏡下選取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)。

1.8細(xì)胞糖代謝的檢測(cè)將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞以每孔105個(gè)接種于12孔板，并加入1 mL DMEM培養(yǎng)基，6 h后將培養(yǎng)基改為低糖的DMEM培養(yǎng)。24 h后分別用葡萄糖測(cè)試試劑盒、乳酸檢測(cè)試劑盒和ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定葡萄糖、乳酸和ATP的濃度。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0和GraphPad 6.0進(jìn)行分析。應(yīng)用秩和檢驗(yàn)比較膽囊癌和癌旁正常組織中PKM2蛋白表達(dá)的差異，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較PKM2 siRNA和陰性對(duì)照組細(xì)胞中PKM2蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖、侵襲和糖代謝水平的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1膽囊癌和癌旁正常組織中PKM2蛋白的表達(dá)水平見(jiàn)表1。免疫組化結(jié)果顯示膽囊癌組織中PKM2蛋白的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.760，P<0.001)。

表1 膽囊癌及癌旁正常組織中PKM2蛋白的表達(dá)

Z=4.760，P<0.001

2.2PKM2siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖能力的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，轉(zhuǎn)染PKM2 siRNA后，GBC-SD和NOZ細(xì)胞的增殖能力均下降。

圖1 膽囊癌細(xì)胞增殖曲線

2.3PKM2siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)膽囊癌細(xì)胞中PKM2蛋白的定位及表達(dá)的影響見(jiàn)圖2和表2。免疫熒光結(jié)果顯示PKM2蛋白只在GBC-SD和NOZ細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，胞核中無(wú)表達(dá)。Western bolt結(jié)果顯示PKM2 siRNA組GBC-SD、NOZ細(xì)胞中PKM2蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組。

圖2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中PKM2蛋白的 免疫熒光(上)、Western bolt(下)檢測(cè)結(jié)果

組別nGBC-SD細(xì)胞NOZ細(xì)胞陰性對(duì)照組30.96±0.030.98±0.01PKM2 siRNA組30.17±0.030.22±0.04t32.25231.926P<0.001<0.001

2.4PKM2siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)膽囊癌細(xì)胞侵襲能力和細(xì)胞糖代謝能力的影響見(jiàn)圖3和表3。由圖3和表3可知，PKM2 siRNA組GBC-SD和NOZ細(xì)胞侵襲能力均受到抑制，葡萄糖消耗量、細(xì)胞外乳酸生成和ATP消耗量均下降。

圖3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(×100)

組別nGBC-SD細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)c(葡萄糖消耗量)/(mmol/L)c(細(xì)胞外乳酸生成量)/(mmol/L)ATP消耗量/(μmol/g)NOZ細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)c(葡萄糖消耗量)/(mmol/L)c(細(xì)胞外乳酸生成量)/(mmol/L)ATP消耗量/(μmol/g)陰性對(duì)照組3214.6±18.1510.10±0.729.65±0.72106.30±8.87177.1±10.859.99±0.619.44±0.61117.26±12.13PKM2 siRNA組3122.7±22.203.93±0.205.13±0.4147.01±7.0976.2±9.583.57±0.264.13±0.3544.35±3.52t5.5518.0755.8545.22212.0709.7238.3435.779P0.0050.0010.0040.006<0.001 <0.0010.0010.005

3 討論

我國(guó)膽囊癌發(fā)病率居膽道腫瘤首位，位列消化道腫瘤第7位，且好發(fā)于50～70歲，與慢性膽囊炎、膽石癥具有密切的關(guān)系[10]。由于膽囊癌早起缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，以及缺少有價(jià)值的臨床檢測(cè)方法，其診斷常被延誤。因此，探索新的能夠早期預(yù)測(cè)膽囊癌的生物學(xué)分子指標(biāo)具有重要的臨床意義。

即使在有氧條件下，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞仍然選擇糖酵解方式獲取能量，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為Warburg效應(yīng)[11]；該文獻(xiàn)報(bào)道，Warburg效應(yīng)在惡性腫瘤進(jìn)展中具有重要作用，有望成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。丙酮酸激酶是糖酵解過(guò)程中的主要限速酶之一，能夠使磷酸烯醇式丙酮酸和ADP變?yōu)楸岷虯TP。與線粒體呼吸不同的是，丙酮酸激酶的能量再生與氧氣供應(yīng)無(wú)關(guān)[12]。PKM2是丙酮酸激酶的一種重要的同工酶，常在一些分化的組織中以及在具有高核酸合成率的細(xì)胞中表達(dá)，如肺組織、脂肪組織和正常增殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞[13-14]。

有研究[15]報(bào)道PKM2在癌細(xì)胞葡萄糖代謝過(guò)程中具有重要的作用，也可作為蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，是腫瘤代謝和細(xì)胞功能的樞紐蛋白分子。同時(shí)PKM2在許多癌細(xì)胞中高表達(dá)，與惡性腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有著密不可分的關(guān)系。朱珠等[16]的研究結(jié)果顯示，PKM2能夠通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞糖代謝來(lái)促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。Wei等[17]的研究證實(shí)，沉默PKM2后，乳腺癌細(xì)胞的增殖能力顯著下降，并且細(xì)胞凋亡率增加。何中林等[18]發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中，PKM2的高表達(dá)提示預(yù)后不良。本研究結(jié)果表明，PKM2在膽囊癌組織中高表達(dá)。利用干擾RNA手段沉默PKM2的表達(dá)后，GBC-SD和NOZ細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力均顯著下，同時(shí)兩種細(xì)胞的葡萄糖消耗量、細(xì)胞外乳酸生成量和ATP消耗量均明顯減少，上述結(jié)果提示PKM2可能是通過(guò)介導(dǎo)Warburg效應(yīng)促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述，PKM2可能與膽囊癌細(xì)胞的增殖、侵襲等密切相關(guān)，可作為一個(gè)潛在的提示膽囊癌進(jìn)展的生物標(biāo)志物和治療干預(yù)的靶標(biāo)。