徐偉良，郭梁,3，李春冬，郭元晟,3，郝苗苗，王亞慧，王東玉，朱建軍，錢俊平,3，雅梅,3

（1.錫林郭勒職業(yè)學院，內(nèi)蒙古錫林浩特026000；2.錫林郭勒生物工程研究院，內(nèi)蒙古錫林浩特026000；3.錫林郭勒食品檢驗檢測和風險評估中心，內(nèi)蒙古錫林浩特026000）

0引 言

乳品發(fā)酵劑通常指用于酸奶、奶酒、奶豆腐、奶酪、奶油等發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)的細菌以及其他微生物的培養(yǎng)物。市場上常見發(fā)酵劑大多由益生菌組成，例如，酸奶發(fā)酵劑一般由嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌兩種乳酸菌組成[1]；馬奶酒發(fā)酵劑由酵母菌聯(lián)合嗜酸乳桿菌及瑞士乳桿菌組成[2]；蒙古族奶豆腐發(fā)酵劑由乳酸鏈球菌和乳油鏈球菌組成[3]。益生菌（Probiotics）是一類能夠促進宿主腸內(nèi)微生物菌群的生態(tài)平衡，對宿主健康或生理功能產(chǎn)生有益作用的活性微生物[4]。迄今為止，科學家已發(fā)現(xiàn)的益生菌大體上可分成三大類，其中包括乳桿菌屬（如干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、詹氏乳桿菌等）；雙歧桿菌屬（如長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌、卵形雙歧桿菌等）和革蘭氏陽性球菌屬（如乳球菌、糞鏈球菌、中介鏈球菌等）[5-7]。此外，明串球菌屬、丙酸桿菌屬和芽孢桿菌屬的部分菌種株，以及一些霉菌與酵母菌等亦可歸入益生菌的范疇[8]。

利用分子生物學方法對微生物多樣性的鑒定可分為非培養(yǎng)模式與培養(yǎng)模式兩種[9]。非培養(yǎng)模式采用直接從樣品中提取微生物的核酸，通過菌群的核酸進行序列分析。這種非培養(yǎng)模式的分子生物學方法避開了微生物分離培養(yǎng)的過程，能夠更加深入快捷的了解微生物的多樣性[10]。然而這種方法也存在一定的弊端，引物與模版的匹配性、樣品中微生物含量過少、一些核酸片段的共泳效應等問題的存在，都可能導致核酸的不可檢測。培養(yǎng)模式一般是通過傳統(tǒng)的微生物分離方法進行大量的平板分離，選擇合適的培養(yǎng)基對分離的微生物進行培養(yǎng)。通常選擇乳酸細菌培養(yǎng)基（MRS）對乳酸菌進行培養(yǎng)，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）對酵母菌等真菌進行培養(yǎng)[11]。根據(jù)菌落的形態(tài)和顏色進行隨即挑選，進一步使用隨機擴增多態(tài)性PCR（Random Amplified Polymorphic DNA-PCR，RAPD-PCR）、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、基因外重復回文系列PCR（Repetitive Extragenic Palindromic，Rep-PCR）、脈沖場凝膠電泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)等方法對微生物的親緣關(guān)系及多樣性進行分析[12-13]。然而在菌落挑選階段，由于大量的菌落基本相似，難以憑肉眼區(qū)分，這在一定程度上影響了多樣性研究的準確性。因此，將非培養(yǎng)模式與培養(yǎng)模式兩種方法結(jié)合使用，對微生物多樣性的鑒定分析，才能更加準確有效。

蒙古族乳制品歷史悠久，作法考究，風味獨特，是蒙古族人民的必需食物之一[14]。錫林郭勒盟地區(qū)作為內(nèi)蒙古的產(chǎn)乳大盟，也是三大綠色黃金乳源基地之一，具有豐富的傳統(tǒng)乳制品資源，包括奶豆腐、酸奶、奶酒、奶皮子、奶酪、稀奶油及黃油等[15]。遺憾的是，這些乳制品的生產(chǎn)仍處于傳統(tǒng)的手工作坊階段，大多數(shù)產(chǎn)品采用自然發(fā)酵，導致質(zhì)量差異很大，且不穩(wěn)定。以傳統(tǒng)奶豆腐為例，其在發(fā)酵過程中采取的即為自然發(fā)酵,利用自身和環(huán)境中的微生物進行發(fā)酵,但由于在整個發(fā)酵過程中微生物環(huán)境比較復雜且存在不確定性,生產(chǎn)出的奶豆腐的感官、品質(zhì)都不穩(wěn)定，不能大規(guī)模、工業(yè)化生產(chǎn)[16]。因此，為了更好地開發(fā)蒙古傳統(tǒng)乳制品，研發(fā)適合乳制品發(fā)酵的發(fā)酵劑，提高了產(chǎn)品的品質(zhì)和穩(wěn)定性，使傳統(tǒng)蒙古族乳制品形成規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化，是具有非常重要的意義。

1 器材與試劑

1.1 材料

商用發(fā)酵劑（購于商業(yè)公司，微生物成分保密）。

1.2 試劑

Takara快速提取試劑盒（Code No.9164）；100 bp DNA Ladder（Lot#L20208）；EasyTaq?PCR Super Mix（Lot#K20614）；Takara Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（Code No.9762）；MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉粉7.5 g、酵母浸粉5 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸二銨 2 g、乙酸鈉 5 g、葡萄糖 20 g、吐溫-80 1 mL、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂15 g、蒸餾水 1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯切片200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水 1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.3 儀器

FA2004N電子天平、SW-J-2FD凈化工作臺、HWS-250BX恒溫恒濕培養(yǎng)箱、厭氧袋（含產(chǎn)氣包、厭氧指示劑）、2720 Thermal Cycler PCR擴增儀、MLS-3751L-PC高溫高壓滅菌鍋、5418R臺式高速離心機、WD-9413B凝膠成像儀、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1 乳品發(fā)酵劑供試樣品的分子鑒定

2.1.1 DNA提取

發(fā)酵劑的基因組總DNA采用Takara快速提取試劑盒對其進行提取。取50μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR于滅菌的EP管中。用滅菌槍頭挑取單菌落，置于EP管中攪拌幾下。80℃熱變性15 min，低速離心（8000 rpm，5 min），將上清液取出放入新的EP管中，作為PCR反應的模板。

2.1.2 PCR擴增

選用真菌通用引物ITS1/ITS4與ITS4/ITS5擴增5.8S rDNA基因片段。引物序列分別為：ITS1（5'-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3'），ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）。細菌選用16S rDNA V3片段的 2對通用引物（27F/1495R）用于擴增。引物序列分別為：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1495R(5'-CTACGGCTACCT-TGTTACGA-3')。擴增結(jié)果用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.1.2.1 PCR反應體系

40μL反應體系：模板DNA 2μL、引物各2μL、dd H2O 14μL、EasyTaq PCR Super Mix 20μL。

2.1.2.2細菌PCR反應條件

94℃預變性5 min；94℃變性 1 min、58℃退火1 min、72℃延伸2 min，共30循環(huán)；72℃末端延伸10 min；

2.1.2.3 真菌PCR反應條件（Touchdown）

第一階段，95℃預變性 3 min；95℃變性30 s、69℃退火30 s、每循環(huán)降低退火溫度1℃、72℃延伸1 min，共15循環(huán)。第二階段，95℃變性30 s、47℃退火30 s、72℃，延伸 1 min，共20循環(huán)；73℃加強延伸1 min。

2.1.3 序列測定

將PCR擴增產(chǎn)物利用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0進行回收。具體步驟如下：在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠放置于EP管中，向膠塊中加入溶解液Buffer GM，振蕩混合，放入50℃金屬浴中溶解膠塊。將溶解的膠塊溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column，12 000 rpm離心1 min，棄濾液。再將700μL的Buffer WB加入 Spin Column中，室溫12 000 rpm離心1 min，重復上述操作一次。將Spin Column安置于新的EP管上，在Spin Column膜的中央處加入30μL滅菌蒸餾水靜置1 min后室溫12 000 rpm離心1 min洗脫DNA。將回收的DNA擴增產(chǎn)物送北京睿博生物科技有限公司，用相同引物進行測序。測序結(jié)果經(jīng)拼接后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源比對。

2.2 發(fā)酵劑樣品中益生菌的分離培養(yǎng)

取一定量無菌處理好的樣品轉(zhuǎn)移至50 mL含0.85%生理鹽水的三角瓶內(nèi)，將三角瓶在漩渦振蕩器上振蕩3 min。震蕩后用接種環(huán)取稀釋后的菌液，分別在PDA、MRS兩種平板培養(yǎng)基上進行劃線，將MRS平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，厭氧培養(yǎng)3 d；PDA平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長狀況。

2.3 分離菌種的分子鑒定

通過菌落觀察PDA平板培養(yǎng)基中未有微生物菌落生長，因此，只在分離培養(yǎng)的6個平行皿的MRS平板培養(yǎng)基中，分別隨機挑取3個單菌落進行基因組總DNA的提取。同樣采用Takara快速提取試劑盒對菌落總DNA進行提取，PCR擴增同“2.1.2.2”PCR反應條件。

3 結(jié)果與討論

3.1 發(fā)酵劑DNA測定結(jié)果

將乳品發(fā)酵劑以細菌27F/1495R為引物，設置3個平行，進行PCR反應，并將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳（如圖1A）。由圖1A可知，D1、D2、D3的三個重復電泳條帶在1 500 bp處清晰且唯一，沒有其他雜帶，說明該條帶是經(jīng)過PCR擴增反應得到的特異性帶，符合27F/1495R為引物的目的條帶大小。將乳品發(fā)酵劑分別以真菌ITS1/ITS4和ITS4/ITS5為引物，并設置3個平行，進行PCR反應，并將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳（如圖1B）。由圖1B可知，分別以ITS1/ITS4和 ITS4/ITS5為引物的3個平行樣（D1～D3與d1～d3），均未出現(xiàn)目的條帶，可推測發(fā)酵劑中不含酵母菌等真菌菌群。并由圖1C發(fā)酵劑供試樣基因測序結(jié)果可知，基因測序序列有雜峰，在排除樣品干擾的情況下，推測可能存在多類乳酸菌，因此，將發(fā)酵劑進行菌種分離培養(yǎng)，進一步對其進行菌種鑒定。

圖1 發(fā)酵劑PCR擴增產(chǎn)物電泳圖與序列測定結(jié)果

3.2 發(fā)酵劑菌種分離培養(yǎng)結(jié)果

將乳品發(fā)酵劑通過微生物培養(yǎng)方法，分別接到MRS和PDA平板培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果如圖2。由圖2可知，發(fā)酵劑在PDA平板培養(yǎng)基中未有微生物菌落生長，與圖1B電泳結(jié)果一致，因此可以確定，發(fā)酵劑中不含酵母菌等真菌菌群。由MRS培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)結(jié)果可知，MRS有乳酸菌菌落生長，且通過觀察，發(fā)現(xiàn)存在不同形態(tài)特征的單菌落，因此可以推斷發(fā)酵劑中不僅存在一種發(fā)酵劑菌群，還需進一步對菌株進行基因鑒定。

圖2 發(fā)酵劑菌種分離培養(yǎng)結(jié)果

3.3 發(fā)酵劑菌種序列鑒定結(jié)果

隨機挑取MRS培養(yǎng)基上18個單菌株（C1-C18）進PCR擴增，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送測序公司進行序列測序。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源比對表明，18個單菌株ident均為100%，其中13株為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）；5株為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。

圖3 發(fā)酵劑菌種PCR擴增產(chǎn)物電泳圖與序列測定結(jié)果

4 結(jié)論與討論

通過基因鑒定（16SrDNA和ITS）與分離培養(yǎng)兩種方式對發(fā)酵劑中微生物組成進行分析，最終確定該種商用發(fā)酵劑是由植物乳桿菌（L.plantarum）和干酪乳桿菌（L.casei）組成。植物乳桿菌（L.plantarum）是乳酸菌的一種，廣泛存在自然發(fā)酵乳制品中，是許多發(fā)酵食品揮發(fā)性風味形成的重要菌株。植物乳桿菌能夠產(chǎn)生有機酸、細菌素、雙乙酰等多種天然活性成分，具有維持腸道內(nèi)菌群平衡，提高機體免疫力，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種保健作用[17-18]。干酪乳桿菌（L.casei）屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）的乳酸菌，與常用的嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌兩大益生菌，一起被稱為“健康三益菌”。干酪乳桿菌能夠水解蛋白質(zhì)，具有非常顯著的產(chǎn)酸和產(chǎn)香能力，常作為增香的輔助發(fā)酵劑應用在發(fā)酵制品生產(chǎn)中[19-20]。通過對以上對兩種乳桿菌的研究，可以認定該種商用乳品發(fā)酵劑能夠增加發(fā)酵乳制品的風味，提高其品質(zhì)，在發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)加工中具有重要的作用。目前，隨著我國人均生活消費水平的不斷提高，消費者對具有營養(yǎng)保健功能的益生菌發(fā)酵乳制品的需求越來越大，使得益生菌發(fā)酵劑具有極為廣闊的市場應用前景。然而，現(xiàn)有商業(yè)發(fā)酵劑的種類較少、微生物多樣性較低、供需的巨大差異等局限性，從而鼓勵研究人員從自然發(fā)酵食品中分離、鑒定以及開發(fā)益生菌資源。本研究中的微生物培養(yǎng)、分離及鑒定為錫林郭勒草原自然發(fā)酵乳制品中的益生菌資源開發(fā)提供了有益借鑒。