崔英俊，于廣璞，湯云飛，李慧銘，邊艷杰，孫喆，劉智宇，孫霞

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，哈爾濱150030）

0 引 言

奶牛乳腺分支形態(tài)發(fā)育是成功泌乳的基本條件。有效的乳腺分支結(jié)構(gòu)能提高乳腺腺泡的數(shù)量和分泌功能，提高奶牛乳產(chǎn)量。乳腺發(fā)育過(guò)程由體內(nèi)微環(huán)境構(gòu)建龐大的激素網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，其復(fù)雜程度對(duì)乳腺發(fā)育機(jī)理的研究造成困難，而乳腺體外模型有利于階段性的觀察。目前對(duì)乳腺分支模型的研究多見(jiàn)于小鼠和人，尚無(wú)關(guān)于奶牛乳腺分支模型的報(bào)道[1-3]。

本研究利用從青春期奶牛乳腺中提取的類(lèi)器官，在I型膠原中以鑲嵌式進(jìn)行三維培養(yǎng)，用FGF2處理來(lái)建立奶牛乳腺分支模型，旨在通過(guò)奶牛乳腺分支模型的建立，為進(jìn)一步在體外研究奶牛乳腺分支的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及取材

處于青春期的健康荷斯坦奶牛，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。

1.2 試劑和儀器

Ⅳ型膠原酶，鼠尾Ⅰ型膠原，DMEM/F12，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF2），DnaseⅠ內(nèi)切酶，胰島素/轉(zhuǎn)鐵蛋白/硒（insulin/transferrin/selenium，ITS）。

1.3 方法

1.3.1 奶牛乳腺類(lèi)器官的獲取

取新鮮健康青春期荷斯坦奶牛乳腺組織，去除脂肪組織和結(jié)締組織后，清洗并剪成1 mm3的組織小塊。將組織小塊放入100 mL的DMEM/F12溶液（質(zhì)量濃度為1 g/L的Ⅳ型膠原酶）中，于37℃搖床上消化3 h。將消化液用銅網(wǎng)過(guò)濾，濾液分裝在用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%BSA預(yù)鋪好的10 mL離心管中，在轉(zhuǎn)速為1 500 r/min下離心15 min。將沉淀用DMEM/F12懸浮，加入濃度為2 000 U/mL的DnaseⅠ靜置后，轉(zhuǎn)速為1 500 r/min下離心10 min，收集沉淀。然后加入DMEM/F12溶液10 mL，重懸細(xì)胞沉淀。之后放入離心機(jī)中（1 500 r/min）3～4 s后停止，收集沉淀。此即為奶牛乳腺類(lèi)器官沉淀。

將沉淀置于10 mL的DMEM/F12中充分混勻，從中轉(zhuǎn)移50μL的混液，置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。將調(diào)整好質(zhì)量濃度的混液以1 500 r/min室溫離心，收集沉淀。

1.3.2 奶牛乳腺類(lèi)器官鑲嵌入Ⅰ型膠原

將鼠尾Ⅰ型膠原的pH值調(diào)到中性，然后用DMEM/F12培養(yǎng)液在冰上調(diào)節(jié)鼠尾Ⅰ型膠原質(zhì)量濃度（終質(zhì)量濃度3 g/L）。在鋪膠之前將鼠尾Ⅰ型膠原放在4℃冰箱中預(yù)冷1 h。

在24孔板上預(yù)鋪20μLⅠ型膠原，37℃放置待Ⅰ型膠原完全凝固后，將收集好的類(lèi)器官沉淀與Ⅰ型膠原混勻，加在預(yù)鋪好的24孔板上，每個(gè)孔150μL。放入37℃的培養(yǎng)箱中1 h，待Ⅰ型膠原完全凝固，每孔加入2 mLDMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液（含1×ITS），F(xiàn)GF2組另加入FGF2（終質(zhì)量濃度50 ng/mL）。每隔2天換1次液。

1.3.3 奶牛乳腺三維培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察

在初加入培養(yǎng)基時(shí)利用相差顯微鏡拍照，此時(shí)定為0 h。分別在第0，12，36，60，84 h進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.4 奶牛乳腺三維培養(yǎng)的分支率計(jì)算

選擇放大倍數(shù)為100倍的照片，每張照片隨機(jī)挑選3個(gè)不同視野，視野內(nèi)類(lèi)器官總數(shù)不少于50個(gè)，進(jìn)行類(lèi)器官計(jì)數(shù)。

分支率的計(jì)算公式為：具有分支形態(tài)的類(lèi)器官/類(lèi)器官總數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)奶牛乳腺分支率進(jìn)行t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均數(shù)（M）±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 奶牛乳腺類(lèi)器官的獲取

將新鮮健康青春期荷斯坦奶牛乳腺組織剪成小塊，加入Ⅳ型膠原酶溶液中（質(zhì)量濃度為1 g/L的Ⅳ型膠原酶），37℃消化3 h，過(guò)濾。將濾液分裝在預(yù)鋪好2.5%BSA的離心管中，1 500 r/min離心15 min，取上層脂肪層再次混勻離心，收集兩次沉淀，沉淀在鏡下觀察如圖1a?？梢?jiàn)細(xì)胞中有絮狀物雜質(zhì)。加入2 000 U/mL的DnaseⅠ混勻靜置5 min，靜置后，在鏡下觀察見(jiàn)絮狀物消失（圖1b）。重懸細(xì)胞沉淀，放入離心機(jī)中（1 500 r/min）3～4 s，差速離心后收集沉淀可見(jiàn)單細(xì)胞基本清除，剩下團(tuán)狀的細(xì)胞組織（圖1c）。詳細(xì)流程如圖2所示。

圖1 奶牛乳腺類(lèi)器官的提取過(guò)程中的鏡下觀察

2.2 奶牛乳腺三維培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察及分支率計(jì)算

通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組在84 h內(nèi)無(wú)分支形態(tài)出現(xiàn)（圖3A1-A5）；FGF2組在36 h時(shí)鏡下即可見(jiàn)分支形態(tài)（圖3B3）。分支率計(jì)算的結(jié)果表明，從36 h開(kāi)始，F(xiàn)GF2組分支率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖4）。

A1-A5分別代表對(duì)照組乳腺上皮類(lèi)器官在0，12，36，60，84 h的形態(tài)學(xué)變化；B1-B5分別代表FGF2乳腺上皮類(lèi)器官在 0，12，36，60，84h的形態(tài)學(xué)變化（200×）。

3 結(jié)果與討論

乳腺與肺、腎、唾液腺等上皮器官一樣，能通過(guò)分支形態(tài)發(fā)生而形成樹(shù)狀結(jié)構(gòu)[4]。細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）是體內(nèi)平衡和組織表型的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，它為乳腺上皮細(xì)胞提供細(xì)胞因子，提供生物力學(xué)支撐，并參與細(xì)胞膜表面的信號(hào)傳導(dǎo)[5]。早期研究認(rèn)為驅(qū)使乳腺上皮侵入脂肪墊并形成分支的過(guò)程，與ECM重塑相關(guān)的酶有關(guān)[3]。

圖2 奶牛乳腺類(lèi)器官的提取流程

圖3 奶牛乳腺上皮類(lèi)器官在三維培養(yǎng)中的形態(tài)學(xué)變化

圖4 奶牛乳腺上類(lèi)器官在三維培養(yǎng)中的分支率

在對(duì)乳腺分支形態(tài)發(fā)生進(jìn)行體外研究時(shí)，三維培養(yǎng)能比二維培養(yǎng)更好得模擬體內(nèi)情況，在研究細(xì)胞行為和功能方面更有說(shuō)服力[6]。青春期的乳腺分支結(jié)構(gòu)，可以通過(guò)將乳腺上皮細(xì)胞鑲嵌在Ⅰ型膠原中，并用細(xì)胞因子刺激來(lái)進(jìn)行三維培養(yǎng)而重現(xiàn)[4，7]。Ⅰ型膠原是正常乳腺ECM中最豐富的成分[5，8]。之后人們通過(guò)在Ⅰ型膠原中鑲嵌培養(yǎng)稱(chēng)為類(lèi)器官的小塊雌性小鼠乳腺腺體，在體外也重現(xiàn)了乳腺導(dǎo)管發(fā)育。乳腺分支形態(tài)形成還取決于細(xì)胞因子的相互作用，在I型膠原中培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞時(shí)，乳腺分支被肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF)-α、FGF7和FGF2上調(diào)，被TGF-β家族成員抑制，但是這些細(xì)胞因子的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究[9-10]。

本研究將自青春期奶牛乳腺組織中獲取的類(lèi)器官鑲嵌在Ⅰ型膠原中進(jìn)行三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在FGF2作用下，與對(duì)照組相比，奶牛乳腺類(lèi)器官自36 h開(kāi)始就具有了明顯的分支形態(tài)，且之后分支率一直顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明已成功建立奶牛乳腺分支模型，這與在人和小鼠中得到的結(jié)果相一致[2-3]，證實(shí)了乳腺分支模型的建立方法在反芻動(dòng)物中也同樣可行。這個(gè)模型也將為奶牛乳腺分支相關(guān)機(jī)理的研究提供物質(zhì)條件和理論基礎(chǔ)。