王麗麗，楊軍國(guó)，林清霞，項(xiàng)麗慧，宋振碩，張應(yīng)根，陳林

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

有機(jī)酸是組成茶葉香氣和滋味的主要成分之一，占茶葉干物質(zhì)總量的3%左右[1]。茶葉中有機(jī)酸種類較多，茶葉（湯）中經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有機(jī)酸有40余種，其中茶湯中有10余種，香氣成分中有30余種[2]。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，茶葉中的有機(jī)酸具有諸多生物學(xué)活性：一方面，可介導(dǎo)合成酚類、氨基酸、酯類和芳香化合物等物質(zhì)，參與茶樹(shù)的新陳代謝，并且可作為生化反應(yīng)中糖類分解的中間產(chǎn)物；另一方面，可有效協(xié)同增強(qiáng)茶多酚激活α-淀粉酶和胰蛋白酶活性表達(dá)，增強(qiáng)茶多酚的抗氧化活性，促進(jìn)兒茶素在人體中吸收轉(zhuǎn)化，具有減輕關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等生理功能[1-3]。因此，定性與定量分析茶葉中的有機(jī)酸，是對(duì)茶葉生產(chǎn)過(guò)程中品質(zhì)調(diào)控研究必不可少的內(nèi)容，在茶葉生物學(xué)活性研究中亦具有重要的意義。

已報(bào)道的茶葉有機(jī)酸分析方法有酸堿滴定法、氣相色譜法、離子交換色譜法、毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法等[2-4]，其中：酸堿滴定法靈敏度低，氣相色譜法需進(jìn)行復(fù)雜衍生化處理，離子交換色譜法存在無(wú)機(jī)陰離子干擾，毛細(xì)管電泳法重現(xiàn)性較差，而液相色譜法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、分離效果好的特點(diǎn)，是目前最廣泛使用的檢測(cè)手段。在所建立的茶葉有機(jī)酸高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）檢測(cè)中，測(cè)定組分主要包括草酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等，還包括乳酸、酒石酸、抗壞血酸、富馬酸、甲酸、丙酮酸、α-酮戊二酸等[5-8]。本文在前人研究的基礎(chǔ)上綜合了茶葉中可能檢測(cè)到的10種有機(jī)酸，期望建立一種多茶類通用的有機(jī)酸同步快速HPLC檢測(cè)方法，以期對(duì)茶葉風(fēng)味品質(zhì)調(diào)控起到一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

綠茶、白茶、烏龍茶（清香型鐵觀音）、紅茶和普洱茶，自制。

1.1.2 試劑

磷酸（H3PO4，優(yōu)級(jí)純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司）；10種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品：D/L-酒石酸（純度99.8%）、乙酸（純度99.7%）、富馬酸（純度99.8%）、乳酸（純度91.2%）、琥珀酸（純度99.5%）（以上均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司），草酸和抗壞血酸（純度100%，中國(guó)食品藥品檢定研究院），檸檬酸（純度100%，中國(guó)藥品生物制品檢定所），甲酸溶液[HPLC級(jí)，含量49%～51%（T），美國(guó)Fluka公司]，L-蘋果酸（純度94.2%，美國(guó)ChromaDex公司）。

1.1.3 儀器

美國(guó)Agilent1260型液相色譜系統(tǒng)，包括四元泵（G1311C VL）、標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器（G1329B）、柱溫箱（G1316A）和二極管陣列檢測(cè)器（G1315D VL）；AL204電子天平（美國(guó)Mettler Toledo公司）；ACD-0502-U實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)（重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）；TSKgel ODS-100V色譜柱（4.6 mm×250mm，5 μm，日本Tosoh公司）；PB-21酸度計(jì)（配PYASI電極，德國(guó)Sartious公司）；PES水系針式濾器（孔徑0.45 μm，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）等。

1.2 HPLC方法的建立

1.2.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確移取甲酸、乳酸、乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，以超純水超聲溶解并定容至10 mL，分別配制成1.5、5.0和10.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液；分別精密稱取草酸、D/L-酒石酸、抗壞血酸、檸檬酸、琥珀酸、L-蘋果酸、富馬酸等標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg（精確至0.1 mg），以超純水超聲溶解并定容至10 mL，除富馬酸配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液外，其余均配制成5 mg/mL的儲(chǔ)備液。上述溶液均過(guò)0.45 μm水系針式濾器，分裝，于－20℃保存，備用。

1.2.2 色譜條件優(yōu)化

分別從檢測(cè)波長(zhǎng)（200～400 nm）、流動(dòng)相配比[流動(dòng)A相（H3PO4水溶液）的pH值為2.27、2.16、2.05，相應(yīng)配制的體積分?jǐn)?shù)為0.06%、0.10%、0.14%；流動(dòng)A相與B相（50%乙腈水溶液）洗脫比例]、柱溫（36、38、40、42 ℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）等方面考察10種有機(jī)酸在TSKgel ODS-100V色譜柱上的分離效果，從而確定適宜的色譜條件。

1.2.3 方法學(xué)考察

從標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限、定量限、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率等方面對(duì)適宜的色譜條件予以考察，驗(yàn)證其運(yùn)行效果。具體步驟如下：取各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，按一定比例稀釋，制成一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用上述色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL。以進(jìn)樣的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，確定線性范圍。將各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋成很低的濃度后進(jìn)樣，分別以3倍和10倍信噪比（S/N）測(cè)得檢測(cè)限和定量限。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的線性范圍，取各有機(jī)酸儲(chǔ)備液適量，混勻，制成含草酸、D/L-酒石酸、甲酸、L-蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸質(zhì)量濃度分別為0.125、0.365、1.200、0.500、0.125、0.700、1.800、0.590、1.225、0.025μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（以下簡(jiǎn)稱“有機(jī)酸混標(biāo)”），于4℃條件下保存，備用。取該有機(jī)酸混標(biāo)上樣分析，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算各組分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation,RSD），考察精密度。平行制備有機(jī)酸混標(biāo)3份，分別進(jìn)樣，計(jì)算各組分峰面積的RSD，考察重復(fù)性。對(duì)同一有機(jī)酸混標(biāo)，分別于配制后的0、2、4、8、12、14和24 h時(shí)進(jìn)樣，計(jì)算組分峰面積的RSD，考察穩(wěn)定性。取已知含量的茶樣1份，分別添加質(zhì)量濃度不等的有機(jī)酸混標(biāo)3份，上樣分析，測(cè)定添加前后茶樣中各標(biāo)準(zhǔn)品含量，考察回收率。

1.3 方法驗(yàn)證性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取磨碎茶樣0.30 g，加45 mL純水，渦旋混勻，沸水浴45 min，冷卻過(guò)濾，用超純水稀釋1倍，過(guò)0.45 μm水系針式濾器后上樣檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector,DAD）在波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)有機(jī)酸混標(biāo)進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果（圖1）顯示，抗壞血酸在245 nm附近有較大吸收值，其余9種有機(jī)酸均在210 nm附近吸收值較大，而且流動(dòng)A相在紫外區(qū)幾乎無(wú)吸收。因此，設(shè)置DAD為雙波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)，分別在210和245 nm處檢測(cè)抗壞血酸，在210 nm處檢測(cè)其他有機(jī)酸。

圖1 10種有機(jī)酸的紫外光譜掃描圖Fig.1 Ultraviolet spectra of 10 organic acids

2.1.2 流動(dòng)相配比的確定

分別以0.06%、0.10%、0.14%的H3PO4水溶液做流動(dòng)A相，測(cè)得溶液pH值依次為2.27、2.16、2.05，并設(shè)置柱溫40℃，流速1 mL/min，有機(jī)酸混標(biāo)溶液進(jìn)樣量10 μL，等度洗脫12 min，在210 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，考察流動(dòng)A相的不同pH值對(duì)有機(jī)酸混標(biāo)中各組分保留時(shí)間的影響。結(jié)果（圖2）表明，因試驗(yàn)所設(shè)pH值（2.05～2.27）的范圍波動(dòng)較小，故僅對(duì)琥珀酸和富馬酸的保留時(shí)間稍有影響，且隨流動(dòng)相pH值的升高，總體檢測(cè)時(shí)間稍有縮短?？紤]到此色譜柱pH值范圍為2.0～7.5，選擇pH值2.16與2.27均可，因此，本試驗(yàn)選擇pH值2.16即以0.10%H3PO4水溶液做流動(dòng)A相。然而，因后續(xù)茶樣測(cè)試采用序列連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)上一針茶樣中殘留的雜質(zhì)對(duì)后續(xù)進(jìn)樣的色譜分離效果造成了不良影響，如出現(xiàn)峰型變胖、雜峰較多、兩峰之間或以上相互重疊、組分分離度變差等現(xiàn)象（圖3），因此在0.10%H3PO4水溶液等度洗脫12 min后，以50%乙腈水溶液（流動(dòng)B相）進(jìn)行梯度洗脫[100%A（12 min）→0%A（17 min）→0%A（25 min）→100%A（30 min）→100%A（33 min），后運(yùn)行2 min]，可有效清除上一針茶樣中保留時(shí)間較長(zhǎng)的殘留雜質(zhì)。

2.1.3 柱溫的確定

設(shè)置柱溫36、38、40、42 ℃，以0.10%H3PO4水溶液做流動(dòng)A相，采取梯度洗脫方式，其余色譜條件不變，進(jìn)樣分析，考察不同柱溫對(duì)各組分保留時(shí)間的影響。結(jié)果（圖4）表明，柱溫為40℃時(shí)，分離10種有機(jī)酸所需檢測(cè)時(shí)間最短，且柱溫越低柱壓越大，色譜柱壽命也相應(yīng)縮短，因此，選用40℃柱溫最佳。

2.1.4 流速的確定

設(shè)置流速0.8、1.0、1.2 mL/min，以0.10%H3PO4水溶液做流動(dòng)A相，采取梯度洗脫方式，其余色譜條件不變，進(jìn)樣分析，考察不同流速對(duì)各組分保留時(shí)間的影響。結(jié)果（圖5）表明，隨著流速的提高，各組分保留時(shí)間明顯縮短，總的檢測(cè)時(shí)間變短，但在1.2 mL/min流速下柱壓最高且D/L-酒石酸和甲酸之間的分離度變差，因此，選用1.0 mL/min流速為宜。

圖2 流動(dòng)A相的不同pH值對(duì)10種有機(jī)酸保留時(shí)間的影響Fig.2 Effect of mobile phase A with different pH values on the retention time of 10 organic acids

圖3 序列進(jìn)樣下茶樣中10種有機(jī)酸的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of 10 organic acids in tea during sequence sampling

由此確定分離10種有機(jī)酸適宜的色譜條件為：采用TSKgel ODS-100V色譜柱，流動(dòng)相由0.10%H3PO4水溶液（A相）和50%乙腈水溶液（B相）組成，以 100%A（0 min）→100%A（12 min）→0%A（17 min）→0%A（25 min）→100%A（30 min）→100%A（33 min）進(jìn)行梯度洗脫，后運(yùn)行2 min，柱溫40℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm和245 nm。在此色譜條件下，有機(jī)酸混標(biāo)中各組分均達(dá)到基線分離，分離效果良好（圖6）。

圖4 不同柱溫對(duì)10種有機(jī)酸保留時(shí)間的影響Fig.4 Effect of different column temperatures on the retention time of 10 organic acids

圖5 不同流速對(duì)10種有機(jī)酸保留時(shí)間的影響Fig.5 Effect of different flow rates on the retention time of 10 organic acids

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

取不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按試驗(yàn)確立的適宜色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得各組分峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限和定量限見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，所有回歸方程的相關(guān)系數(shù)在0.999 5以上，表明10種有機(jī)酸在所測(cè)濃度范圍內(nèi)進(jìn)樣濃度X與峰面積Y呈良好的線性關(guān)系。

圖6 在適宜色譜條件下10種有機(jī)酸的HPLC圖Fig.6 HPLC chromatogram of 10 organic acids under the suitable chromatographic condition

2.2.2 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性

在上述確立的適宜色譜條件下進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果見(jiàn)表2。精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)顯示，所有組分峰面積的RSD均小于1%；穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示，在室溫條件下同一混標(biāo)溶液中抗壞血酸濃度呈直線下降，24 h后含量減少約50%，表明其穩(wěn)定性較差，其余組分峰面積RSD均小于4%，穩(wěn)定性良好；回收率試驗(yàn)表明，各組分回收率為97%～116%。由此表明所建立的高效液相色譜法精密度和重復(fù)性良好，回收率較好，在室溫條件下混標(biāo)溶液中除抗壞血酸外其余組分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合高效液相色譜測(cè)定要求。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程Table 1 Regression equation of standards

表2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性與回收率試驗(yàn)Table 2 Tests on accuracy,repeatability,stability and recovery%

2.3 方法驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

按1.3節(jié)試驗(yàn)方法提取和測(cè)定茶樣3次，得到的色譜圖如圖7所示，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各類茶提取液中有機(jī)酸含量，結(jié)果見(jiàn)表3?？梢钥闯?，在上述適宜的色譜條件下10種有機(jī)酸組分可得到較好的分離。從表3還可以看出，各茶樣中有機(jī)酸總量約占其干物質(zhì)的2%～5%，其中紅茶有機(jī)酸總量最高，琥珀酸和乳酸占其總量的50%以上，白茶的有機(jī)酸總量次之，乳酸和乙酸是其主要成分，烏龍茶的有機(jī)酸含量最低。推測(cè)茶類間有機(jī)酸含量差異的原因可能與其發(fā)酵程度和原料嫩度相關(guān)，相比其他茶類，紅茶發(fā)酵程度最高，而制作烏龍茶（鐵觀音）采用的鮮葉為對(duì)夾二至四葉或一芽三、四葉，嫩度均比綠茶和白茶低。

圖7 綠茶樣中10種有機(jī)酸的HPLC圖Fig.7 HPLC chromatogram of 10 organic acids in green tea samples

表3 茶樣中10種有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Content of 10 organic acids in teasmg/g

3 討論與結(jié)論

本文采用DAD檢測(cè)器對(duì)200～400 nm范圍內(nèi)全紫外波段掃描發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸的最大吸收波長(zhǎng)在245 nm附近，不同于其他9種有機(jī)酸（在210 nm附近），鑒于茶樣中抗壞血酸含量較低，為提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，故選用245 nm作為抗壞血酸的檢測(cè)波長(zhǎng)，將在此波長(zhǎng)下測(cè)得的峰面積用于定量計(jì)算，這與喬方等[9]選用的波長(zhǎng)相同，與文獻(xiàn)[10]采用的波長(zhǎng)254 nm較為接近，而多數(shù)研究推薦210 nm[11-13]，即與其他有機(jī)酸的測(cè)定波長(zhǎng)一致，推測(cè)主要出于檢測(cè)便捷性考慮。此外，抗壞血酸在室溫條件下很不穩(wěn)定，穩(wěn)定性試驗(yàn)表明24 h后其含量降低約50%，因此為獲得可靠的測(cè)試結(jié)果，極有必要低溫保存該標(biāo)準(zhǔn)品溶液及所測(cè)茶樣。更值得一提的是，以0.10%H3PO4水溶液做流動(dòng)相，在等度洗脫12 min后就可分離茶葉中的10種有機(jī)酸，但由于茶樣本身基質(zhì)復(fù)雜，在序列進(jìn)樣中設(shè)置靠前的茶樣里一些水溶性雜質(zhì)會(huì)與后續(xù)所進(jìn)茶樣中的有機(jī)酸組分重疊，導(dǎo)致其分離效果變差。因此，為消除此不良影響，本試驗(yàn)先后嘗試用不同體積分?jǐn)?shù)甲醇水溶液和乙腈水溶液洗脫茶樣中的雜質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10%～90%甲醇仍不足以洗脫雜質(zhì)，而50%乙腈梯度洗脫可有效洗去雜質(zhì)，使受測(cè)試樣品相互不受影響。這與劉晨明等[14]用乙腈來(lái)洗脫培養(yǎng)液中絕大部分保留時(shí)間較長(zhǎng)的物質(zhì)，從而避免干擾下一個(gè)樣品的測(cè)定方法一致。

綜上可見(jiàn)，親水性的TSKgel ODS-100V色譜柱可用于茶葉中有機(jī)酸的分離檢測(cè)，其適宜的色譜條件為：以0.10%H3PO4水溶液（A相）和50%乙腈水溶液（B相）為流動(dòng)相，洗脫梯度為100%A（0 min）→100%A（12 min）→0%A（17 min）→0%A（25 min）→100%A（30 min）→100%A（33 min），后運(yùn)行2 min，柱溫為40℃，流速為1.0 mL/min，DAD在雙波長(zhǎng)210和245 nm下同時(shí)檢測(cè)。用該方法可在35 min內(nèi)同時(shí)分離測(cè)定茶葉中的10種有機(jī)酸。

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