羅龍皂，曾凡健，田光明*

（1.上饒師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；2.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，杭州 310058）

微藻具有不與農(nóng)作物爭地、生長周期短和油脂含量高等特點，可作為生產(chǎn)生物質(zhì)能的理想原材料[1]。然而，微藻生長需要吸收大量的養(yǎng)分，這使得其培養(yǎng)成本較高。因此，很多學(xué)者嘗試采用各種廢水來培養(yǎng)微藻，既收獲了微藻，又使水質(zhì)得到了凈化[2-6]。與其他處理技術(shù)相比，基于微藻培養(yǎng)的廢水處理技術(shù)具有獨特的優(yōu)勢，如無需添加化學(xué)物質(zhì)，具有自產(chǎn)氧及二氧化碳減排能力，生產(chǎn)高附加值生物質(zhì)產(chǎn)品等[7]。

近年來，很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)將微藻和好氧細菌共同培養(yǎng)用于廢水處理較微藻單獨培養(yǎng)更有優(yōu)勢。這是由于好氧細菌的存在會消耗微藻光合作用產(chǎn)生的氧氣，消除因溶解氧過高對微藻生長的抑制，同時將廢水中有機物分解成二氧化碳，為微藻光合作用提供碳源[8]。好氧細菌和微藻的協(xié)同作用不僅可以提高微藻生物量產(chǎn)率，還能省去曝氣操作。而對于一般的生物處理而言，曝氣所需的成本占到了整個處理的50%[9]。因此，利用藻-菌系統(tǒng)來處理廢水能大大降低運行成本，且在微藻培養(yǎng)方面具有很大的優(yōu)勢。目前，有關(guān)藻-菌互作方面的研究主要集中在探明基于微藻的廢水處理系統(tǒng)中存在的優(yōu)勢微生物，以及廢水中主要成分被吸收或分解的基本機制方面[10-12]，而對影響藻-菌系統(tǒng)中微藻生長的相關(guān)因素研究較少，尤其是它們對微生物的分解過程和微藻的光合作用，以及對廢水中氮磷的遷移轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的影響尚不明確。

本文以對養(yǎng)豬廢水凈化潛力大的近具刺鏈帶藻（Desmodesmussp.CHXl）為研究對象，向其中加入對有機物降解效果好的商業(yè)化菌劑，人工構(gòu)建藻-菌共培養(yǎng)系統(tǒng)，探討該培養(yǎng)系統(tǒng)的密閉情況及攪拌速率、藻-菌初始接種比例和廢水有機負荷對藻-菌系統(tǒng)中微藻生長的影響，并對相關(guān)因素進行優(yōu)化，為實現(xiàn)藻-菌系統(tǒng)對廢水的資源化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及菌種

本文所用的微藻為近具刺鏈帶藻（Desmodesmussp.CHXl），由本課題組從養(yǎng)豬廢水中分離獲得[13]。將微藻在藍綠藻培養(yǎng)基（medium for blue green algae,BG11）中培養(yǎng)至對數(shù)期，經(jīng)孔徑為1 μm的醋酸纖維濾膜（上海新亞凈化材料有限公司）過濾后，用超純水洗凈并再次過濾，備用。

所用的菌劑為對廢水中有機物降解效果好的商業(yè)化復(fù)合菌劑（購自上海普羅生物技術(shù)有限公司）。菌劑中優(yōu)勢菌屬為藍細菌（Cyanobacteria）、節(jié)桿菌（Arthrobacter）、芽 孢 桿 菌（Bacillus）和 根 瘤 菌（Rhizobium）等。

1.2 廢水

所用廢水為模擬沼液，在BG11培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改進配制而成。其中有機物、氨氮和總磷主要由無水乙酸鈉、硫酸銨、磷酸二氫鉀配制而成。模擬廢水的基本理化性質(zhì)為：化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand,COD）1 000.01 mg/L、氨氮200.58 mg/L、總氮370.13 mg/L、總磷50.02 mg/L、pH 7.23。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 單因素試驗

1）培養(yǎng)系統(tǒng)密閉情況。將藻-菌培養(yǎng)系統(tǒng)設(shè)置為閉合和敞開2種形式，每個處理設(shè)3個重復(fù)。將微藻和菌劑接種至裝有800 mL廢水（COD為1 000mg/L）的1 000 mL錐形瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。其中藻體質(zhì)量濃度為0.1 g/L，菌劑質(zhì)量濃度為10 g/L。敞開系統(tǒng)的錐形瓶口呈敞開狀態(tài)，閉合系統(tǒng)的錐形瓶口用軟膠塞密封。每個錐形瓶底部有磁力攪拌器，用于混勻藻液。培養(yǎng)條件為溫度30℃、光照強度100 μmol/（m2·s）、24 h全光照、攪拌速率1 000 r/min。

2）藻-菌接種比例對微藻生長的影響。設(shè)置4個不同的藻-菌比例處理，其中藻體質(zhì)量濃度為0.1g/L（按干質(zhì)量計），菌劑質(zhì)量濃度分別為0.1、5、10、20 g/L，對應(yīng)的細菌-微藻比例分別為1∶1、50∶1、100∶1、200∶1，每個處理設(shè)3個重復(fù)。將微藻和菌劑接種至裝有800 mL廢水（COD為1 000 mg/L）的1 000 mL錐形瓶中（瓶口敞開），置于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度30℃、光照強度100 μmol/（m2·s）、24 h全光照、攪拌速率1 000 r/min。

3）培養(yǎng)系統(tǒng)攪拌速率對微藻生長的影響。磁力攪拌器的攪拌速率分別設(shè)置為0、1 000、1 500、2 000、2 500 r/min，共5個處理，每個處理設(shè)3個重復(fù)。將微藻和菌劑接種至裝有800 mL廢水（COD為1 000 mg/L）的1 000 mL錐形瓶中（瓶口敞開），置于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。其中藻體質(zhì)量濃度為0.1 g/L，菌劑質(zhì)量濃度均為10 g/L。培養(yǎng)條件為溫度30℃、光照強度100 μmol/（m2·s）、24 h全光照。

4）廢水有機負荷對微藻生長的影響。設(shè)置廢水COD分別為1 000、2 000、4 000、6 000、8 000 mg/L，共5個梯度，每個處理設(shè)3個重復(fù)。將微藻和菌劑接種至裝有800 mL廢水的1 000 mL錐形瓶中（瓶口敞開），置于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。其中藻體質(zhì)量濃度為0.1 g/L，菌劑質(zhì)量濃度均為10 g/L。培養(yǎng)條件為溫度30℃、光照強度100 μmol/（m2·s）、24 h全光照、攪拌速率1 000 r/min。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取藻-菌接種比例、攪拌速率及有機負荷為主要影響因素，以微藻生物量為響應(yīng)值，考察各因素間的交互作用對微藻生物量的影響。采用Design-Expert 7.5軟件進行分析，選擇三因素三水平的Box-Behnken設(shè)計，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。試驗設(shè)計因素與水平如表1所示。將微藻和菌劑接種至裝有800 mL廢水的1 000 mL錐形瓶中（瓶口敞開），置于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度30℃、光照強度100 μmol/（m2·s）、24 h全光照。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.4 微藻生物量測定

通過測定近具刺鏈帶藻細胞數(shù)來確定其生物量。藻細胞數(shù)采用血球計數(shù)板和顯微鏡測定[14]。微藻生物量（干質(zhì)量，g/L）和微藻細胞數(shù)之間的擬合關(guān)系為：微藻生物量=1.19×10－7×細胞數(shù)（R2=0.992 3）。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用Excel 2013對數(shù)據(jù)進行處理，各組實驗數(shù)據(jù)的顯著性差異分析利用SPSS 20.0軟件進行，其中開放及封閉系統(tǒng)的差異采用配對樣本T檢驗進行分析，其余因素采用單因素方差分析（analysis of variance,ANOVA），顯著水平為0.05。響應(yīng)面優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert 7.5軟件進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻-菌系統(tǒng)中微藻生長的影響因素分析

2.1.1 培養(yǎng)系統(tǒng)密閉情況對微藻生長的影響

圖1為在開放和閉合2種培養(yǎng)方式下藻-菌系統(tǒng)中微藻的生長情況。結(jié)果表明，微藻在開放系統(tǒng)中的生長情況優(yōu)于閉合系統(tǒng)（P＜0.05）。培養(yǎng)7 d后，開放系統(tǒng)中微藻生物量達到4.5 g/L，而閉合系統(tǒng)中為4.3 g/L。造成開放系統(tǒng)中微藻生物量更高的原因可能是：一方面，開放系統(tǒng)中由于培養(yǎng)液和空氣有大面積的接觸，出現(xiàn)高溶解氧抑制微藻生長的可能性較小[15]；另一方面，在開放系統(tǒng)中當氧氣或二氧化碳不足時，可從空氣中獲取，以維持細菌或微藻的生長，而在閉合系統(tǒng)中當氧氣或二氧化碳不足時會影響細菌或微藻的生長。開放式反應(yīng)器的主要代表是跑道式幅板混合藻類塘，現(xiàn)階段98%的商業(yè)化微藻養(yǎng)殖采用此種反應(yīng)器[16]。而密閉式光生物反應(yīng)器由于高昂的設(shè)備及運營成本未能得到廣泛的應(yīng)用[17]。

圖1 微藻在閉合和開放的藻-菌培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長情況Fig.1 Microalgal growth situation in the open and closed algal-bacterial culture systems

2.1.2 藻-菌接種比例對微藻生長的影響

微藻和微生物之間的初始接種比例被認為是影響微藻生長的重要條件之一[15]。本研究設(shè)置了1∶1、50∶1、100∶1、200∶1共4種細菌-微藻初始接種比例（細胞數(shù)之比）來探討它們對藻-菌系統(tǒng)中微藻生長的影響。結(jié)果表明，微藻生物量隨菌-藻接種比例的增大而增加，當菌-藻接種比例為100∶1時系統(tǒng)中微藻生物量最大，隨后微藻生物量隨菌-藻比例增大而降低（圖2）?？梢?，提高菌-藻初始接種數(shù)量有助于微藻生長，但并非越高越好，在本研究中將菌-藻接種比例控制在100∶1更利于微藻生長。當菌-藻接種比例在適合的范圍內(nèi)時，廢水中有充足的氧氣供好氧細菌分解有機物用，同時，也會產(chǎn)生足夠的無機碳源用于微藻光合作用，使微藻生長處于較優(yōu)水平。以上結(jié)果說明菌-藻初始接種比例對微藻生長有著重要影響，而這種影響又因菌-藻種類而異。例如，在小球藻（Chlorellasp.）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）構(gòu)成的藻-菌體系中，對微藻生長促進效果最好的菌-藻比例為1∶2[18]，而在柵藻和敏捷食酸菌（Acidovorax facilis）共生系統(tǒng)中，有利于微藻生長的最佳菌-藻比例為1∶3[15]。

圖2 在藻-菌培養(yǎng)系統(tǒng)中微藻在不同細菌-微藻接種比例條件下的生長情況Fig.2 Microalgal growth situation under different bacteriamicroalgae inoculation ratios in the algal-bacterial culture system

2.1.3 培養(yǎng)系統(tǒng)攪拌速率對微藻生長的影響

為了提高光能利用率、促進氣體交換和提高營養(yǎng)有效性，需要對藻-菌系統(tǒng)進行攪動混合并使其維持在懸浮狀態(tài)。但是攪拌會引起湍流和剪切效應(yīng)，從而影響微藻的生長[19-20]。本研究設(shè)置攪拌速率為0、1 000、1 500、2 000、2 500 r/min 5個處理來探討攪拌速率對微藻生長的影響。結(jié)果表明，在0～1 500 r/min攪拌速率下，微藻生物量隨攪拌速率的增加而增加，當攪拌速率為1 500 r/min時微藻生物量最大，隨后微藻生物量隨攪拌速率的增加而下降（圖3）。當攪拌速率低于1 500 r/min時，提高攪拌速率會增加細胞的養(yǎng)分供應(yīng)并促進系統(tǒng)中氧和二氧化碳的交換速率，從而提高微藻的生物量，然而進一步提高攪拌速率會增加剪切力并損傷細胞，從而使產(chǎn)量迅速降低[21-22]。微藻對剪切力的敏感度與其是否生有鞭毛相關(guān)，因為剪切力會引起鞭毛損傷，從而導(dǎo)致微藻生長速率降低[23]。

圖3 在藻-菌培養(yǎng)系統(tǒng)中攪拌速率對微藻生長的影響Fig.3 Effects of agitating rate on microalgal growth in the algal-bacterial culture system

2.1.4 廢水有機負荷對微藻生長的影響

有機物對微藻生長的影響在很大程度上表現(xiàn)為濃度相關(guān)性，當有機物濃度較低時能促進微藻生長，而高濃度有機物則會抑制微藻生長[24]。本研究探討了廢水有機物質(zhì)量濃度（以COD計）在1 000、2 000、4 000、6 000、8 000 mg/L 5個梯度下微藻的生長情況。結(jié)果表明，當廢水初始COD低于2 000 mg/L時，微藻隨COD升高而增加，當廢水初始COD高于2 000 mg/L時，微藻生物量則隨COD升高而減少（圖4）。說明較低濃度的有機物能促進微藻生長。首先，藻類能直接利用有機物作為生長的營養(yǎng)源，如磷胺在較低濃度時可作為碳源和磷源促進顫藻的生長[25]；其次，較低濃度有機物能促進藻細胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成[26]和引起藻細胞脂質(zhì)過氧化程度升高，從而刺激藻細胞生長[27]；此外，較低濃度有機物有利于細菌將其降解為二氧化碳，為微藻生長提供碳源。

2.2 藻-菌系統(tǒng)中微藻生長條件優(yōu)化

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)定藻-菌接種比例、攪拌速率和有機負荷為優(yōu)化參數(shù)，以微藻生物量為響應(yīng)值，建立響應(yīng)面模型。由表2可知，第11、13、14、15、16號為區(qū)域中心試驗點，其余12組為析因試驗點，取值在每個因素組成的頂點上。零點試驗進行5次重復(fù)，用以估計試驗誤差。

利用Design-Expert 7.5軟件對所得數(shù)據(jù)進行整理分析，得到的微藻生物量二次回歸方程為：

圖4 廢水有機負荷對藻-菌培養(yǎng)系統(tǒng)中微藻生長的影響Fig.4 Effects of organic load on microalgal growth in the algal-bacterial culture system

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for Box-Behnken

根據(jù)表2結(jié)果，用Design-Expert 7.5軟件進行多元回歸分析，回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。該二次多項式回歸模型F值為18.34，P值小于0.01，表明模型極顯著。失擬項F值為4.89，P值為0.079 6，不顯著。模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj值為0.907 0，說明該模型的擬合度良好，試驗誤差小，可以用該模型對微藻的生物量進行分析與預(yù)測。X1、X3、X32對二次響應(yīng)面模型效果的影響達到極顯著水平，其余項的的影響則不顯著，說明藻-菌接種比例和有機負荷對微藻的生長影響顯著。

表3 微藻生物量回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model for microalgal biomass

為確定響應(yīng)面最佳培養(yǎng)條件，運用響應(yīng)面尋優(yōu)方法對回歸方程進行最優(yōu)解分析，得到最佳培養(yǎng)條件為菌-藻接種比例150∶1、攪拌速率1 574.29 r/min和有機負荷（以COD計）3 676.02 mg/L。為檢驗結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進行3次平行驗證試驗。結(jié)果顯示，培養(yǎng)7 d后，微藻的生物量為（5.68±0.32）g/L，與響應(yīng)面模型得到的理論預(yù)測值（5.69 g/L）基本吻合。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗對藻-菌系統(tǒng)中微藻生長條件進行優(yōu)化，確定了最佳培養(yǎng)條件為菌-藻接種比例150∶1、攪拌速率1 574.29 r/min和有機負荷（以COD計）3 676.02 mg/L。在該優(yōu)化條件下對微藻進行培養(yǎng)，7 d后微藻的生物量達到5.68 g/L，與理論預(yù)測值基本吻合。本研究結(jié)果可為提高藻-菌系統(tǒng)對廢水的資源化利用效率提供科學(xué)依據(jù)。

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