高建 林圣 張倩 林潔 張玲華 谷學(xué)英 邵豪 姚克勤 段山

在體外培養(yǎng)細(xì)胞的過程中，經(jīng)常需要判斷細(xì)胞在某些條件下是否能正常生長以及存活率的問題，這就涉及到對(duì)細(xì)胞活性的檢測，也是細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、抗腫瘤藥物篩選以及其它相關(guān)研究的基礎(chǔ)[1，2]。目前，有關(guān)細(xì)胞活性的檢測方法很多，基于吸光度或發(fā)光檢測的商品化試劑盒亦有很多，市場上常見的有CCK-8、alamarBlue 和CellTiter-Glo等[3～5]，三種常用試劑該如何選擇、各自有何特點(diǎn)是相關(guān)學(xué)者較為關(guān)心的問題，另外，對(duì)以上幾種試劑用于兩種不同類型細(xì)胞的檢測參數(shù)和綜合性能評(píng)估的報(bào)道亦較少。本研究選取代表貼壁細(xì)胞類型的人子宮頸癌細(xì)胞株Hela 和代表懸浮細(xì)胞類型的人彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL-2 為研究對(duì)象，對(duì)以上三種試劑分別從接種細(xì)胞數(shù)目、孵育時(shí)間和檢測線性范圍等方面進(jìn)行研究，期望為學(xué)者提供有價(jià)值的實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料人子宮頸癌細(xì)胞株Hela 和人彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL-2 購自于美國ATCC 細(xì)胞資源中心；Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）購自于日本DOJINDO 公司；CellTiter-Glo?Luminescent Cell Viability Assay（簡稱CellTiter-Glo）、GLOMAX Multi Detection System 多功能酶標(biāo)儀購自于美國Promega 公司；alamarBlue?Cell Viability Reagent（簡稱alamarBlue）、Gibco?熱滅活胎牛血清FBS、Gibco?DMEM 培養(yǎng)基、Gibco?RPMI-1640 培養(yǎng)基、Gibco?Trypsin-EDTA（0.25%）和CO2培養(yǎng)箱購自于美國Thermo 公司；10cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔透明和不透明細(xì)胞培養(yǎng)板購自于美國Corning 公司；血球計(jì)數(shù)板購自于上海市求精生化試劑儀器有限公司；熒光倒置顯微鏡購自于美國Leica 公司。

1.2 研究方法

1.2.1 CCK-8 檢測方法 細(xì)胞鋪板：對(duì)于Hela，將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化計(jì)數(shù)后，用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)整到一定密度，接種到96 孔透明細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每100μl 細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目分別為0、2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 和14 000個(gè)/孔；對(duì)于SU-DHL-2，將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞吹散混勻計(jì)數(shù)后，用含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)整到一定密度，接種到96 孔透明細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每100μl細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目分別為0、4 000、8 000、12 000、16 000、20 000、24 000 和28 000 個(gè)/孔；每種細(xì)胞數(shù)目設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)4h。線性范圍確定：向預(yù)培養(yǎng)后的細(xì)胞中，每孔加入10μl CCK-8，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1～4h，每隔1h 用多功能酶標(biāo)儀檢測450nm 波長處的吸光度；根據(jù)平均吸光度值，繪制吸光度隨細(xì)胞和時(shí)間的變化曲線，去掉處于平臺(tái)期的平均吸光度值后，進(jìn)行Pearson 線性相關(guān)分析，確定可檢測細(xì)胞數(shù)線性范圍。

1.2.2 alamarBlue 檢測方法 細(xì)胞鋪板：方法同1.2.1。線性范圍確定：向預(yù)培養(yǎng)后的細(xì)胞中，每孔加入10μl alamarBlue，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1～8h，每隔1h 用多功能酶標(biāo)儀檢測560nm 波長處的吸光度；根據(jù)平均吸光度值，繪制吸光度隨細(xì)胞和時(shí)間的變化曲線，去掉處于平臺(tái)期的平均吸光度值后，進(jìn)行Pearson 線性相關(guān)分析，確定可檢測細(xì)胞數(shù)線性范圍。

1.2.3 CellTiter-Glo 檢測方法 細(xì)胞鋪板：將處于對(duì)數(shù)生長期的Hela 和SU-DHL-2 計(jì)數(shù)后，分別用含10%FBS 的DMEM培養(yǎng)基和含10%FBS 的RPMI- 1640 培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)整到一定密度，接種到96 孔不透明細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每100μl 細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目分別為0、6 250、12 500、25 000 和50 000個(gè)/孔，每種細(xì)胞數(shù)目設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)4h。線性范圍確定：將CellTiter-Glo 的緩沖液室溫溶解后倒入裝有底物凍干粉的棕色瓶中混勻，將預(yù)培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)板拿出，在室溫下平衡30min，然后向每孔中加入100μl 檢測試劑，在多功能酶標(biāo)儀上設(shè)置參數(shù)：震蕩混勻2min，孵育10min，檢測發(fā)光信號(hào)值（RLT）；根據(jù)平均發(fā)光信號(hào)值，如有處于平臺(tái)期的發(fā)光信號(hào)值則舍棄，然后進(jìn)行Pearson 線性相關(guān)分析，確定可檢測細(xì)胞數(shù)線性范圍。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有結(jié)果均采用SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行分析，當(dāng)4 個(gè)復(fù)孔的結(jié)果存在離群值時(shí)剔除該值后再進(jìn)行平均值計(jì)算，以平均吸光度值或平均發(fā)光信號(hào)值作為縱坐標(biāo)，每孔接種細(xì)胞數(shù)目作為橫坐標(biāo)，進(jìn)行Pearson 線性相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 的檢測結(jié)果 對(duì)于Hela 和SU-DHL-2兩種細(xì)胞，吸光度值都會(huì)隨著接種細(xì)胞數(shù)的增多和孵育時(shí)間的延長而均勻增加，隨后進(jìn)入平臺(tái)期，增幅變得越來越?。ㄒ妶D1A 和圖1C）。對(duì)于Hela細(xì)胞，接種數(shù)在0～8 000 之間、孵育時(shí)間為1h 時(shí)線性相關(guān)性最好，Pearson 相關(guān)系數(shù)r為0.997（見圖1B）；對(duì)于SU-DHL-2 細(xì)胞，接種數(shù)在0～28 000之間、孵育時(shí)間在1h 或2h 時(shí)線性關(guān)系比較好，Pearson 相關(guān)系數(shù)r均為0.995（見圖1D）。

2.2 alamarBlue 的檢測結(jié)果 對(duì)于Hela 細(xì)胞，當(dāng)孵育時(shí)間≤5h、接種細(xì)胞數(shù)≤2 000 時(shí)，試劑尚未發(fā)生還原反應(yīng)，導(dǎo)致背景吸光度值比接種細(xì)胞孔的值高或接近（見圖2A），當(dāng)繼續(xù)孵育至6h、7h 時(shí)才能取得非常好的線性，Pearson 相關(guān)系數(shù)r均為0.996（見圖2B）；對(duì)于SU-DHL-2 細(xì)胞，吸光度值隨著接種細(xì)胞數(shù)的增多和孵育時(shí)間的延長增加得非常明顯，但很快進(jìn)入平臺(tái)期（見圖2C）；孵育時(shí)間在2h 時(shí)的線性關(guān)系最好，Pearson 相關(guān)系數(shù)r為0.998（見圖2D）。

圖1 CCK-8 用于Hela 和SU-DHL-2 細(xì)胞活性的檢測及線性范圍

圖2 alamarBlue 用于Hela 和SU-DHL-2 細(xì)胞活性的檢測及線性范圍

2.3 CellTiter-Glo 的檢測結(jié)果 對(duì)于Hela 和SUDHL-2 兩種不同類型的細(xì)胞，當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)在0～50 000 之間時(shí)，平均發(fā)光信號(hào)值和細(xì)胞數(shù)之間均表現(xiàn)出非常好的線性，Pearson 相關(guān)系數(shù)均達(dá)到了0.999，可檢測細(xì)胞線性范圍較寬（見圖3）。

2.4 三種試劑的最佳檢測條件 三種試劑都可用于兩種不同類型細(xì)胞Hela 和SU-DHL-2 的檢測，在可檢測細(xì)胞數(shù)線性范圍和最佳孵育時(shí)間方面均有所不同，可根據(jù)自身的研究需要從中選擇合適的試劑和檢測參數(shù)，見表1。

圖3 CellTiter-Glo 用于Hela 和SU-DHL-2 細(xì)胞活性的檢測及線性范圍

表1 三種試劑檢測兩種細(xì)胞的最佳條件

3 討論

在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，常涉及到對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性的檢測，尤其是在細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性以及細(xì)胞對(duì)藥物敏感度的量化研究方面。在實(shí)際操作過程中，可以通過多種方法檢測所培養(yǎng)細(xì)胞的健康狀況，如質(zhì)膜完整性、DNA 合成、酶活性、ATP 以及代謝活性等，可作為細(xì)胞存活和死亡的指標(biāo)[6～8]。本次研究所選用的三種試劑的檢測原理均是基于以上公認(rèn)的指標(biāo)之一。CCK-8 和alamarBlue 的原理相似，都是在活細(xì)胞線粒體酶的作用下，將底物還原為有顏色的水溶性產(chǎn)物，通過檢測有色產(chǎn)物的吸光度來間接反映活細(xì)胞的數(shù)量[9，10]；CellTiter-Glo 是一種通過對(duì)ATP 進(jìn)行定量測定來反映活細(xì)胞數(shù)目的方法，它采用熒光素酶作檢測物，發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)弱與體系中ATP 的量成正比，而ATP 的量又與活細(xì)胞的數(shù)目呈正相關(guān)，因?yàn)轶w系中的ATP 只能來源于活細(xì)胞的新陳代謝[11，12]。

實(shí)驗(yàn)操作方面，對(duì)于CCK-8 和alamarBlue 兩種試劑，在檢測時(shí)都是直接加入到培養(yǎng)基中混勻即可，孵育結(jié)束后直接用酶標(biāo)儀檢測吸光度，無需裂解細(xì)胞，細(xì)胞在檢測完畢后還可以繼續(xù)培養(yǎng)或用于其它實(shí)驗(yàn)；由于CCK-8 的顏色與含酚紅的培養(yǎng)基比較接近，應(yīng)盡量避免漏加或多加的情況；而alamarBlue 加入培養(yǎng)基后溶液立刻變成藍(lán)色，很容易區(qū)分，但是當(dāng)細(xì)胞濃度過高或孵育時(shí)間過長時(shí)，會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性還原反應(yīng)，進(jìn)而使有色產(chǎn)物顏色消失，整個(gè)操作過程還應(yīng)嚴(yán)格避光，并且保證無菌操作，因?yàn)槲⑸镂廴疚锿瑯涌梢赃€原檢測試劑而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13]；對(duì)于CellTiter-Glo 試劑，將底物凍干粉和緩沖液混勻平衡至室溫后，與培養(yǎng)基等體積加入，混勻孵育10min 后即可檢測，也不受培養(yǎng)基中酚紅和有機(jī)溶劑的影響，但是細(xì)胞不可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樵诜跤^程中被充分裂解，檢測時(shí)必須用不透明的培養(yǎng)板和配套發(fā)光檢測設(shè)備。

在檢測結(jié)果方面，以上三種試劑都可同時(shí)用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的增殖和活性測定，在一定范圍的細(xì)胞數(shù)目和孵育時(shí)間內(nèi)，均能表現(xiàn)出很好的線性關(guān)系，Pearson 相關(guān)系數(shù)均在0.99 以上。對(duì)于CCK-8 試劑，在最佳孵育時(shí)間均為1h 的情況下，懸浮細(xì)胞SU-DHL-2 的檢測線性范圍遠(yuǎn)大于貼壁細(xì)胞Hela；對(duì)于alamarBlue 試劑，兩種細(xì)胞的檢測線性范圍相當(dāng)，但是孵育時(shí)間卻存在較大差別，對(duì)于貼壁細(xì)胞，需要較長的孵育時(shí)間；對(duì)于CellTiter-Glo 試劑，兩種細(xì)胞的結(jié)果表現(xiàn)一致，檢測的線性范圍較寬，孵育時(shí)間只需要10min，相關(guān)性也是最好，由于加樣體積的增大和光信號(hào)自身的特性，大大降低了系統(tǒng)誤差，使得結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性都較高[14]。

綜上所述，三種試劑在一定的條件下，均能取得令人滿意的結(jié)果。對(duì)于CCK-8 和alamarBlue 兩種試劑，實(shí)驗(yàn)操作最為簡單，屬于即開即用型，成本也相對(duì)較低，檢測后的細(xì)胞經(jīng)洗滌可重復(fù)使用，可進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞活力檢測、細(xì)胞周期分析或與增殖有關(guān)的細(xì)胞表面抗體測定等，缺點(diǎn)是需要耗費(fèi)較長時(shí)間來摸索最佳檢測條件，CCK-8 對(duì)貼壁細(xì)胞的檢測線性范圍較窄，alamarBlue 對(duì)貼壁細(xì)胞的孵育時(shí)間較長，二者對(duì)懸浮細(xì)胞的檢測效果較好；對(duì)于CellTiter-Glo 試劑，操作時(shí)需要先行解凍并平衡至室溫后使用，需要配套儀器來混勻和檢測發(fā)光信號(hào)，整體成本較高，因細(xì)胞在檢測過程中被裂解而不可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，但是該試劑孵育時(shí)間僅需要10min，對(duì)兩種類型細(xì)胞的線性檢測范圍較寬，對(duì)細(xì)胞數(shù)目要求不嚴(yán)格，自動(dòng)化程度較高，尤其適合大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選以及細(xì)胞毒性試驗(yàn)等，檢測效率、靈敏度和準(zhǔn)確性均較好。