張禮茜，陳雪瑩，范碧蓮，李文博，殷浩然，顧子琨，崔巖，袁月鳴，孟禹彤，方葉，金戈

（1.沈陽醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)2015、2016級，遼寧 沈陽 110034；2.公共衛(wèi)生學院預防醫(yī)學專業(yè)2015級；3.基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學教研室）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是癡呆的一種常見類型，臨床表現(xiàn)為認知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進行性減退，并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙［1］。全球現(xiàn)有3 500多萬癡呆患者，每年新增病例460萬。65歲以上老年人的發(fā)病率每5年翻一番。到2040年，全球癡呆病例將達到8 110萬［2］。AD成為目前危害老年人健康最常見的疾病之一，給家庭帶來沉重的精神及經(jīng)濟負擔。然而目前治療AD的藥物有限，獲得美國FDA批準的臨床藥物包括膽堿酯酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑等［3］。因此，研發(fā)新的治療AD的藥物十分迫切。從中藥天然產(chǎn)物中篩選安全、有效、多靶點的藥物為AD治療提供新思路成為研究熱點。水飛薊賓（silibinin）是菊科植物水飛薊果實中提取的黃酮木脂類化合物的最主要成分，臨床上用于治療急慢性肝炎、肝硬化及中毒性肝損傷［4］。有文獻報道水飛薊賓能夠改善學習記憶障礙，但機制尚未明確。本研究采用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠進一步評價水飛薊賓提高學習記憶能力及探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 6月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，雄性，體重（30±2）g，由北京華阜康生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物合格證號：SCXK（京）2014-0004。將實驗動物按體重隨機分為模型組、美金剛組、水飛薊賓低和高劑量組；另選取平行月齡C57BL/6J小鼠為空白對照組，每組10只。實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24℃，濕度60%左右，自由攝食飲水，12 h循環(huán)光照。實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后?？瞻讓φ战M和模型組給予生理鹽水，美金剛組給予2.6 mg/kg美金剛，水飛薊賓低、高劑量組分別給予100 mg/kg、200 mg/kg水飛薊賓，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃給藥6周余，行為學實驗時期繼續(xù)給藥。

1.2 藥品及試劑 水飛薊賓（湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號20130804）；美金剛（丹麥靈北藥廠，進口藥品注冊證號H20120268）；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，E-EL-0026c、E-EL-0060c、EEL-M2398c）；突觸素（synaptophysin，SYP）、生長 相 關(guān) 蛋 白（growth-associated protein 43，GAP-43）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。

1.3 儀器及裝置 Morris水迷宮裝置及檢測分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；酶標定量測試儀（奧地利特TECAN公司）；-80℃低溫冰箱（中科美菱）；低溫超速離心機（美國BECK?MAN公司）；機械勻漿機（上海凈信科技公司）；透射電鏡（日本電子株式會社）。

1.4 方法

1.4.1 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮實驗裝置為一個直徑為100 cm白色圓形水池及一個直徑約10 cm的安全平臺。水溫22～24℃。實驗分為三部分：（1）適應(yīng)環(huán)境，在無安全平臺的情況下每只小鼠自由探索1 min。（2）定向航行：將安全臺放置在第四象限，將小鼠從不同入水口放入水中，電腦同時進行數(shù)據(jù)采集并記錄其找到安全平臺的時間（逃避潛伏期），小鼠在安全平臺停留5 s后采集自動停止。數(shù)據(jù)采集時間為60 s，小鼠每天訓練2次，連續(xù)訓練5 d。（3）空間探索：定向航行試驗結(jié)束后，撤除安全平臺，將小鼠放入水池中，自由探索60 s，第6天進行。攝像系統(tǒng)在規(guī)定時間內(nèi)記錄小鼠在安全平臺所在象限游泳的時間、路程及穿越安全平臺所在位置的次數(shù)等指標。本研究采用定向航行游泳距離、空間探索目標象限停留時間百分比分析水飛薊賓改善學習記憶障礙的作用。

1.4.2 ELISA 法檢測小鼠腦皮質(zhì)組織中 MDA、GSH、SOD含量 將小鼠腦皮質(zhì)組織10～20 mg以1∶10的體積比加入磷酸鹽緩沖液，組織勻漿；3 000×g離心2次，每次10 min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測MDA、GSH、SOD含量。

1.4.3 電鏡下觀察小鼠突觸的超微結(jié)構(gòu) 將小鼠腦海馬組織固定后進行脫水包埋，先用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次5 min；然后用1%鋨酸固定液固定后，經(jīng)梯度酒精、丙酮處理后包埋。將包埋后的組織樣本進行固化，超薄切片機切片50 nm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察。

1.4.4 ELISA法檢測小鼠腦皮質(zhì)組織中突觸相關(guān)蛋白SYP、GAP-43的表達 組織處理同1.4.2。具體按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測SYP、GAP-43的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用最小顯著性差異法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 水飛薊賓對APP/PS1小鼠水迷宮實驗游泳距離及目標象限停留時間百分比的影響 與對照組比較，模型組小鼠的游泳距離顯著增加（P＜0.05），目標象限停留時間百分比顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，水飛薊賓100 mg/kg、200 mg/kg組及美金剛組小鼠游泳距離顯著減少，目標象限停留時間百分比顯著增加（P＜0.05）。見表1。

表1 水飛薊賓對APP/PS1小鼠Morris水迷宮游泳距離及目標象限停留時間百分比的影響（n=10）

2.2 水飛薊賓對APP/PS1小鼠腦皮質(zhì)組織中MDA、GSH和SOD含量的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠腦皮質(zhì)組織中MDA含量顯著升高，SOD和GSH含量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，水飛薊賓組小鼠腦皮質(zhì)組織中的MDA含量顯著降低，水飛薊賓200 mg/kg組SOD和 GSH含量顯著增加（P＜0.05），水飛薊賓 100 mg/kg組GSH含量顯著增加（P＜0.05）。見表2。

表2 水飛薊賓對APP/PS1小鼠腦皮質(zhì)組織中MDA、GSH和SOD含量的影響（n=5）

2.3 水飛薊賓對APP/PS1小鼠突觸超微結(jié)構(gòu)的改善作用 透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組突觸數(shù)量較多，突觸前膜內(nèi)突觸小泡含量豐富，突觸間隙清楚，突觸后致密物厚度較大且均勻。與對照組比較，模型組突觸數(shù)量減少，突觸結(jié)構(gòu)模糊，前后膜融合，小泡含量較少，突觸后致密物厚度較薄。與模型組相比，水飛薊賓200 mg/kg組突觸數(shù)量較多，突觸結(jié)構(gòu)較為清晰，突觸間隙明顯，可見豐富的突觸小泡和較厚的突觸后致密物。見圖1。

2.4 水飛薊賓對APP/PS1小鼠腦皮質(zhì)組織中突觸相關(guān)蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組小鼠腦皮質(zhì)組織中SYP和GAP-43蛋白表達含量均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，水飛薊賓低、高劑量組腦皮質(zhì)組織中SYP以及水飛薊賓200 mg/kg組GAP-43蛋白表達含量均顯著升高（P＜0.05）。見表3。

圖1 透射電鏡下水飛薊賓對APP/PS1小鼠腦突觸超微結(jié)構(gòu)的改善作用（×20 000）

表3 水飛薊賓對APP/PS1小鼠腦皮質(zhì)組織中突觸相關(guān)蛋白表達的影響（n=5）

3 討論

水飛薊素主要含有水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊亭及水飛薊寧等活性成分，其中，以水飛薊賓活性最強、含量最高。研究顯示，水飛薊素能消除體內(nèi)活性氧，對抗脂質(zhì)過氧化、肝纖維化，是各種病毒性肝炎、肝纖維化、酒精性肝損害以及其他中毒代謝性肝損害的有效治療藥物。水飛薊素可以顯著改善海馬注射Aβ1-40大鼠學習記憶障礙，通過降低APP表達，抑制Aβ斑塊的形成［5-6］；抑制LPS誘導脊髓小膠質(zhì)細胞分泌iNOS［7］。氧化應(yīng)激能夠通過增加APP的表達，調(diào)節(jié)β分泌酶和γ分泌酶的活性，促進Aβ的生成。Aβ寡聚體能促進Tau蛋白的磷酸化，形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFT）。Aβ在胞外沉積形成的老年斑（SP）和NFT會進一步促進氧化應(yīng)激反應(yīng)并延長炎癥反應(yīng)，對神經(jīng)元造成不可逆的損傷并最終導致神經(jīng)元的死亡［8-9］。突觸作為神經(jīng)元之間信息傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，具有改變其長度和結(jié)構(gòu)的能力，稱為突觸可塑性，是腦內(nèi)學習和記憶的神經(jīng)生物學基礎(chǔ)［10］。SYP是突觸囊泡最豐富的蛋白之一，超過90%的突觸囊泡都含有SYP，可作為反映突觸密度的標志［11］。SYP在突觸囊泡轉(zhuǎn)運、與突觸前膜錨靠、融合并釋放神經(jīng)遞質(zhì)中起重要作用。SYP能夠促進囊泡離開網(wǎng)狀細胞骨架，移向突觸前膜并與之融合。SYP對鈣離子依賴性的神經(jīng)遞質(zhì)（乙酰膽堿和谷氨酸等）的釋放過程中起著重要作用［12-13］。AD患者SYP減少與認知功能下降密切相關(guān)［14-15］。GAP-43對神經(jīng)發(fā)育、軸突的再生、突觸的發(fā)生、信號傳導及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放均起著重要作用［16-17］。神經(jīng)損傷后軸突再生和反應(yīng)性突觸形成都伴隨著GAP-43表達增加，GAP-43可作為突觸可塑性的一個標志物［18］。Morris水迷宮實驗是行為藥理學中最常用的測試方法之一，常被用來評估嚙齒類動物的空間學習記憶能力［19-20］。文獻報道水飛薊賓顯著減少AD模型小鼠逃避潛伏期及游泳距離［19］。

本實驗結(jié)果顯示，水飛薊賓可顯著改善APP/PS1小鼠Morris水迷宮空間探索中游泳距離、定向航行目標象限停留時間百分比等指標。形態(tài)學結(jié)果顯示水飛薊賓200 mg/kg能夠顯著修復突觸超微結(jié)構(gòu)損傷的作用；另外，水飛薊賓200 mg/kg可促進突觸相關(guān)蛋白SYP、GAP-43的表達，減少APP/PS1小鼠腦中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，增加SOD及GSH的含量，抑制氧化應(yīng)激。水飛薊賓改善APP/PS1小鼠學習記憶障礙的機制可能與促進抗氧化應(yīng)激因子的表達，改善突觸結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)。