趙祥宇，吳劉中，史春，盧永平，郭傳波

（1. 沈陽(yáng)市口腔醫(yī)院修復(fù)科，沈陽(yáng) 110002； 2. 沈陽(yáng)市口腔醫(yī)院牙周科，沈陽(yáng) 110002；3. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科，遼寧 大連116044；4. 遼寧省計(jì)劃生育科學(xué)研究院優(yōu)生遺傳科，沈陽(yáng) 110031）

自從口腔種植體骨整合理論提出后，種植體材料不斷創(chuàng)新，種植技術(shù)日趨成熟，種植體的成功率也越來(lái)越高［1］。但是種植修復(fù)后的并發(fā)癥 （種植體周?chē)?、種植體周?chē)つぱ?、種植失敗） 仍然是種植醫(yī)師面臨的棘手問(wèn)題。種植體周?chē)资狗N植體周?chē)浗M織和支撐骨組織功能喪失，是導(dǎo)致種植體松動(dòng)失敗的主要原因［2］。近年來(lái)研究［3-4］結(jié)果表明，種植體周?chē)椎陌l(fā)生不是均勻分布的，而是呈現(xiàn)聚集性，這種聚集現(xiàn)象的發(fā)生與遺傳異質(zhì)性相關(guān)［5］。

種植體周?chē)着c牙周炎的發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)相似，有牙周炎病史會(huì)增加種植體周?chē)椎幕疾★L(fēng)險(xiǎn)［6］。研究［7］表明炎癥細(xì)胞因子的基因多態(tài)性影響患者牙周細(xì)菌感染的炎癥反應(yīng)程度，也決定個(gè)體對(duì)牙周炎的易感性。牙周炎的發(fā)生與患者基因型相關(guān)，約50%以上牙周炎患者的病因是基因問(wèn)題［8］。同樣地，炎癥細(xì)胞因子的基因多態(tài)性在種植體周?chē)椎陌l(fā)生中也起重要作用［9］。

白細(xì)胞介素-1 （interleukin-1，IL-1） 是結(jié)締組織分解代謝的刺激劑，具有增強(qiáng)白細(xì)胞向組織遷移，激活成纖維細(xì)胞和免疫有核細(xì)胞的作用。 IL-1定位于2q13，包括IL-1 α、IL-1 β 和IL-1γn3種。這些基因的遺傳多態(tài)性影響基因產(chǎn)物的表達(dá)，進(jìn)而影響炎癥的發(fā)生。有研究［10-11］報(bào)道IL-1多態(tài)性對(duì)種植體周?chē)椎陌l(fā)生有重要作用。本研究通過(guò)對(duì)IL-1基因進(jìn)行分型，分析基因多態(tài)性與種植體周?chē)装l(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

選取2008年9月至2015年9月沈陽(yáng)市口腔醫(yī)院種植科行種植體義齒修復(fù)的患者 （203例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：至少植入1顆及以上種植牙，并且完成修復(fù)時(shí)間1年及以上。根據(jù)患者有無(wú)種植體周?chē)追譃镻I組 （有種植體周?chē)祝?16例） 和NPI組 （無(wú)種植體周?chē)祝?7例）。分組標(biāo)準(zhǔn)［12］：種植體周?chē)皆\出血，化膿以及骨損失≥2 mm為種植體周?chē)祝粺o(wú)探診出血，化膿和骨損失<2 mm為無(wú)種植體周?chē)?。PI組男47例，女69例，年齡32～64歲，平均年齡 （45.3±2.6）歲；牙周炎94例，無(wú)牙周炎22例；吸煙23例，不吸煙93例。NPI組男36例，女51例；年齡29～61歲，平均年齡 （43.2±3.4） 歲，牙周炎56例，無(wú)牙周炎31例；吸煙7例，不吸煙80例。2組患者性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=0.015，P = 0.900；t = 0.68，P = 0.625），牙周炎、吸煙患者人數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2分別為7.16、5.48，P分別為0.007、0.019）。所有患者均知情同意并簽署了知情同意書(shū)。

1.2 樣本采集和DNA提取

患者清水漱口后用無(wú)菌棉簽在雙側(cè)臉頰內(nèi)部上下輕刷數(shù)次，使棉簽充分接觸口腔黏膜。取樣后放入裝有生理鹽水的離心管中保存。用口腔拭子基因組DNA提取試劑盒 （中國(guó)天根公司） 提取DNA，用 NanoDrop 1000 （美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司） 測(cè)定DNA濃度，用TE （10 mmol/L Tris，0.1 mmol/L EDTA，0.5mol/L NaCl） 統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化為50 ng/μ L。

1.3 IL-1基因多態(tài)性位點(diǎn)選擇及PCR擴(kuò)增

在千人基因組官網(wǎng) （http：//www.internationalgenome.org） 下載中國(guó)人群IL-1 α、IL-1 β 和IL-1γn的單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)信息，用Haploview 4.2 （https：//www.broadinstitute.org/haploview/haploview） 進(jìn)行分析，以MAF>0.1，r2>0.8進(jìn)行tagger分析， 分別選擇rs2856838、 rs3136558、 rs4252001作為IL-1 α，IL-1 β和IL-1γn的標(biāo)記 SNP進(jìn)行基因分型，見(jiàn)圖1。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法 （polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP） 進(jìn)行基因分型。PCR反應(yīng)體系：DNA 1 μ L，2×Taq PCR MasterMix 10 μ L，正、反義引物 （10 nmol/L） 各0.6 μ L，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至20 μ L。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保持。各基因PCR引物、內(nèi)切酶及片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

1.4 限制性酶切及電泳

PCR完成后，取2.5 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物，分別加入相應(yīng)的內(nèi)切酶 （2 U），加入10×CutSmart Buffer 1 μ L，去離子水補(bǔ)足至10 μ L。37 ℃反應(yīng)2 h，取5 μ L酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳條帶進(jìn)行基因分型。

圖1 Haploview軟件對(duì)IL-1 α、IL-1 β、IL-1γn進(jìn)行標(biāo)記 SNP分析結(jié)果Fig.1 Tagged SNP results for IL-1 α，IL-1 β，and IL-1γn analyzed by Haploview

表1 各基因PCR引物、內(nèi)切酶及酶切片段長(zhǎng)度Tab.1 Primer，endonucleases，and length of products of each gene

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)各SNP位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組間的基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-1 α、IL-1 β 和IL-1γn的SNP酶切結(jié)果

結(jié)果顯示，IL-1 α基因rs2856838經(jīng)HpyCH4Ⅳ酶切后，GG基因型為92 bp和115 bp 2條帶，純合型AA為207 bp 1條帶，而雜合型GA為3條帶。IL-1 β基因rs3136558經(jīng)DpnⅡ酶切后，TT基因型為35 bp 、170 bp 2條帶，純合型CC為205 bp 1條帶，雜合型CT基因型為3條帶。IL-1γn基因rs4252001經(jīng)PsiⅠ酶切后，AA基因型為27 bp和206 bp 2條帶，純合型GG為233 bp 1條帶，雜合性AG為3條帶。見(jiàn)圖2。

2.2 2組基因型分布比較

圖2 多態(tài)位點(diǎn)酶切后電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of SNP

結(jié)果顯示，IL-1 α 基因rs2856838位點(diǎn)中，與GG基因型比較，AA基因型PI組與NPI組中分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P < 0.05），GA基因型2組分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P > 0.05）。IL-1 β基因 rs3136558和IL-1γn基因rs4252001位點(diǎn)各等位基因型分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P > 0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

種植體周?chē)啄苁怪С止菃适?，形成種植體周?chē)钛乐艽?，從而?dǎo)致種植失敗。2008年第6屆歐洲牙周病學(xué)術(shù)研討會(huì)［13］明確口腔衛(wèi)生差、牙周炎病史和吸煙是種植體周?chē)椎娘L(fēng)險(xiǎn)因素，這在本研究中得到了證實(shí)。近年來(lái)研究［14］表明，微生物、遺傳因素等對(duì)種植體周?chē)椎陌l(fā)生也至關(guān)重要。微生物和遺傳易感性是種植患者發(fā)生種植體周?chē)罪L(fēng)險(xiǎn)更高的原因［15］。

IL-1基因多態(tài)性作為種植體周?chē)椎奈ｋU(xiǎn)因素越來(lái)越受到研究者的重視。雖然LACHMANN等［16］研究未能發(fā)現(xiàn)IL-1基因型與種植體周?chē)字g存在相關(guān)性，但是越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)IL-1基因與種植體周?chē)装l(fā)生相關(guān)。有學(xué)者通過(guò)meta分析發(fā)現(xiàn)IL-1 α和IL-1 β 復(fù)合基因型是植入失敗和種植體周?chē)椎奈ｋU(xiǎn)因素［17］，HAMDY 等［18］通過(guò)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)IL-1基因型在種植體周?chē)捉M與非種植體周?chē)捉M間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以往研究［9，18］大多集中在IL-1 α-899C>T、IL-1 β +3954C>T位點(diǎn)上。IL-1α-899C>T和IL-1 β +3954C>T位點(diǎn)在亞洲 （特別是中國(guó)） 人群中最小等位基因頻率較低 （分別為0.09和0.03）。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法，選擇了基因頻率較高的3個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行組間基因型頻率和等位基因頻率分析，以此來(lái)研究IL-1基因在種植體周?chē)椎陌l(fā)生中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)IL-1 α 基因rs2856838位點(diǎn)為AA基因型比GG基因型發(fā)生種植體牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)高3.34倍，與以往研究［9，19-20］結(jié)果相同，驗(yàn)證了IL-1 α 基因在種植體周?chē)装l(fā)生中起重要作用。然而未發(fā)現(xiàn)IL-1 β 和IL-1γn基因的基因型與種植體周?chē)装l(fā)生具有相關(guān)性 （P > 0.05）。這可能與本研究納入樣品數(shù)少有關(guān)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)吸煙患者與不吸煙患者比較更容易發(fā)生種植體周?chē)?，進(jìn)一步證實(shí)吸煙影響種植體周?chē)椎陌l(fā)生。

表2 PI組和NPI組基因型分布比較Tab.2 Genotype distribution of PI group and NPI group

綜上所述，IL-1參與種植體周?chē)椎陌l(fā)生過(guò)程，IL-1 α 基因rs2856838的AA基因型與種植體周?chē)椎陌l(fā)生具有相關(guān)性。本研究探討了IL-1基因多態(tài)性與種植體周?chē)椎南嚓P(guān)性，由于樣本數(shù)量較少，目前對(duì)于遺傳異質(zhì)性以及不同環(huán)境因素影響等方面的研究較少，因此，有必要開(kāi)展多中心聯(lián)合研究，擴(kuò)大樣本量，對(duì)基因多態(tài)性、環(huán)境因素與種植體周?chē)椎年P(guān)系進(jìn)行深入研究。