張曉楠，馮浩，白雪，應(yīng)曼曼，孫勝男，寧宏

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，沈陽 110001）

脈絡(luò)膜黑色素瘤是成人最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，具有高轉(zhuǎn)移率和死亡率，超過90%的患者會發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，平均生存時間為7個月。作為黑色素瘤中最致命的一類，脈絡(luò)膜黑色素瘤患者即使接受過治療，仍然有約50%會發(fā)生轉(zhuǎn)移，10年生存率約為50%［1-3］。視力喪失是脈絡(luò)膜黑色素瘤的主要危害之一，超過1/3的患者需要摘除眼球［4］。脈絡(luò)膜黑色素瘤的早期診斷和治療是提高患者生存率的關(guān)鍵。對脈絡(luò)膜黑色素瘤發(fā)生發(fā)展機制的深入研究將有助于發(fā)現(xiàn)新的診斷和治療方法。

腫瘤的發(fā)生常表現(xiàn)為失控性的細胞增殖。細胞周期依賴性激酶 （cyclin-dependent kinases，CDKs） 連續(xù)地激活和抑制則是增殖調(diào)控的關(guān)鍵因素。眾多研究表明，P16-cyclinD-CDK4/6-RB 通路在脈絡(luò)膜黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，但探討CDK4與脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞增殖的研究卻鮮有報道。同時，多種微小RNA （microRNAs，miRNAs） 也被證實與脈絡(luò)膜黑色素瘤密切相關(guān)。miR-15b-5p是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA，它能夠與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)結(jié)合，通過抑制靶基因的表達發(fā)揮功能，且它在多種疾病中發(fā)揮的生物學(xué)功能不盡相同。目前尚未見關(guān)于miR-15b-5p調(diào)節(jié)脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞增殖的報道。

因此，本研究從關(guān)鍵基因CDK4入手，參考miRNAs調(diào)控機制，檢測miR-15b-5p與CDK4的靶向調(diào)控作用，進而探究miR-15b-5p在脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞惡性增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 雙熒光素酶報告檢測

將miR-15b-5p與CDK4 3’UTR結(jié)合區(qū)域的野生型 （WT） 序列和突變型 （MT） 序列插入至pMIR-REPORT熒光素酶質(zhì)粒中，合成pMIR- REPORT Luciferase-CDK4-3’UTR （WT） 和pMIR- REPORT Luciferase-CDK4-3’UTR （MT） 2種質(zhì)粒，用海腎熒光素酶質(zhì)粒pmirGLO作為對照 （以上質(zhì)粒由和元生物公司合成提供） 。將細胞分為4組： （1） WT+nc組，共轉(zhuǎn)染CDK4 3’UTR野生型質(zhì)粒與negative control RNA； （2）WT+mi組，共轉(zhuǎn)染CDK4 3’UTR野生型質(zhì)粒與mir-15b-5p mimics； （3） MT+nc組，共轉(zhuǎn)染CDK4 3’UTR突變型質(zhì)粒與negative control RNA； （4） MT+mi組，共轉(zhuǎn)染CDK4 3’UTR突變型質(zhì)粒與miR-15b-5p mimics。在質(zhì)粒和RNA共轉(zhuǎn)染293T細胞72 h后，使用雙熒光素酶報告檢測試劑盒 （美國Promega公司） 檢測熒光強度。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人眼侵襲性脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞系MUM-2B購自上海拜力生物技術(shù)有限公司，在含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中使用含10%的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司） 培養(yǎng)。microRNA negative control（nc） ，miR-15b-5p mimics，microRNA inhibitor nc，miR-15b-5p inhibitor由蘇州吉瑪基因公司合成。使用lipofectamineTM3000 （美國Life Technologies Corporation公司） 轉(zhuǎn)染RNA。將上述RNA和lipofectamine3000分別與無血清培養(yǎng)基混合，再將2種混合物相互混合，靜置15 min，加入到更換新鮮培養(yǎng)基的細胞中。

1.3 實時熒光定量PCR

使用總RNA提取試劑盒 （miRcute miRNA Isolation Kit，北京天根生化科技有限公司天根） 提取總RNA；使用微量分光光度計 （英國BioDrop公司） 檢測RNA的質(zhì)量和純度；使用miRNA PCR試劑盒 （Hairpin-itTMmicroRNA and U6 snRNA Normalization RTPCR Quantitation Kit，蘇州吉瑪基因公司） 完成反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR；使用PCR儀 （LightCycler 480Ⅱ，瑞士Roche 公司） 檢測熒光。采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。以上操作均按照各自試劑操作手冊進行。

1.4 Western blotting

使用RIPA 裂解緩沖液 （上海碧云天生物技術(shù)公司） 提取總蛋白，使用BCA蛋白檢測試劑盒 （上海碧云天生物技術(shù)公司） 檢測蛋白濃度。以每孔20 μg蛋白上樣，10% SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜 （美國BIO-RAD公司） ，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入CDK4抗體 （1︰1 000，ab108357，美國Abcam公司）和GAPDH抗體 （1︰5 000，5174s，美國Cell Signaling Technology公司） 于4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次，于37 ℃孵育二抗 （ZB-2301，山羊抗兔1︰5 000，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司） 1 h。使用ECL試劑 （美國Pierce公司） 在發(fā)光儀MicroChemi4.2 （以色列DNR公司） 上檢測條帶的熒光亮度。

1.5 CCK-8細胞增殖實驗

采用CCK-8試劑盒（ 日本Dojindo公司） 檢測細胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染24 h后的細胞接種于96孔板中（3×103/孔） ，分別于0、24、48和72 h每孔加入混合有10 μL CCK8試劑的100 μL培養(yǎng)基，于37 ℃孵育2 h后，使用酶標儀（ Model 680，美國Bio-Rad公司） 檢測450 nm波長吸光度（ optical density，OD） 值。

1.6 細胞周期檢測

細胞轉(zhuǎn)染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h后用胰酶消化收集細胞，使用PBS重懸細胞并用70%乙醇固定24 h。檢測前每管細胞用500 μL PI/RNase常溫避光染色30 min。使用流式細胞儀FACSCalibur （美國BD公司） 檢測。使用cellQuest Pro分析檢測結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析與作圖。每個結(jié)果重復(fù)3次。使用兩樣本t檢驗比較2組數(shù)據(jù)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-15b-5p與CDK4的結(jié)合情況

利用生物信息學(xué)網(wǎng)站Targetscan 7.0進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-15b-5p的種子序列與CDK4的3’UTR區(qū)域含有匹配的區(qū)段。使用雙熒光素酶報告實驗驗證二者具有直接結(jié)合的位點及結(jié)合能力 （結(jié)合序列見圖1A） 。4組細胞熒光素酶相對活性結(jié)果如圖1B所示，WT+mi組熒光素酶活性 （0.880 7±0.025 67） 明顯低于WT+nc組 （1.141 0±0.033 69） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P < 0.01） 。而MT+nc組與MT+mi組的熒光素酶活性（0.980 7±0.048 09，0.968 0±0.0268 9），則無統(tǒng)計學(xué)差異 （P = 0.696 4） 。

圖1 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-15b-5p與CDK4 mRNA的3’-UTR區(qū)域直接結(jié)合Fig.1 Dual-luciferase assay result showed that CDK4 was a direct target of miR-15b-5p

2.2 miRNA的轉(zhuǎn)染效率

通過實時熒光定量PCR檢測miR-15b-5p表達水平。如圖2所示，mimics組miR-15b-5p的相對表達量為nc組的389.3% （P < 0.000 1） ，提示轉(zhuǎn)染mimics能有效增加miR-15b-5p表達水平；同時，inhibitor組miR-15b-5p的相對表達量為inhibitor nc組的3.166%（P < 0.000 1） ，提示轉(zhuǎn)染inhibitor能有效減低miR-15b-5p表達水平。

圖2 實時熒光定量PCR檢測miR-15b-5p表達水平Fig.2 The expression level of miR-15b-5p detected using QRT-PCR

2.3 CDK4蛋白的表達量

通過Western blotting檢測CDK4蛋白的表達量，結(jié)果如圖3所示，與nc組相比，mimics組CDK4蛋白條帶的相對灰度值升高（0.610±0.079），差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P < 0.01） ；與inhibitor nc組相比，inhibitor組CDK4蛋白條帶的相對灰度值降低（1.331±0.099），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P < 0.05） 。

2.4 miR-15b-5p對脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞增殖的影響

用CCK-8實驗測定細胞增殖能力，結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染72 h時nc組與mimics組的相對OD值分別為2.486±0.075 19和1.671±0.044 61，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P < 0.001） ，與nc組相比，mimics組細胞的增殖能力下降；細胞轉(zhuǎn)染72 h時，inhibitor nc組與inhibitor組的相對OD值分別為3.300±0.095 89和4.513±0.189 20，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P < 0.01） ，與inhibitor nc組相比，inhibitor組細胞的增殖能力升高。

圖3 Western blotting檢測CDK4蛋白表達量Fig.3 The expression level of CDK4 detected by Western blotting

圖4 CCK-8檢測miR-15b-5p對脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞增殖的影響Fig.4 The effect of miR-15b-5p on the proliferation of choroidal melanoma cells detected by CCK-8

2.5 miR-15b-5p對脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞周期的影響

使用流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期情況。如圖5所示，mimics組細胞G1期的比例［（ 81.79±0.750 2） %］較nc組［ （ 75.98±0.499 7） %］增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01） ；inhibitor組細胞G1期比例［（ 70.82±1.013 0） %］較inhibitor nc組［（ 76.36±0.978 4） %］減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P < 0.05） 。

3 討論

脈絡(luò)膜黑色素瘤的發(fā)生存在多種機制，如基因突變、染色體缺失或易位以及信號通路的異常激活等。研究［5-8］發(fā)現(xiàn)，脈絡(luò)膜黑色素瘤中，p16的甲基化失活較為常見，cyclin D1呈高表達，促進CDK4磷酸化Rb；Rb的磷酸化可以釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F1，促進細胞周期從G1期向S期推進，進而促進細胞的惡性增殖。這些證據(jù)都表明，p16-cyclinD-CDK4/6-RB通路與脈絡(luò)膜黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CDK4作為通路中的核心分子，很有可能發(fā)揮了重要的作用。雖然一些關(guān)于遺傳易感性的研究［9-10］發(fā)現(xiàn)脈絡(luò)膜黑色素瘤中沒有CDK4的可遺傳突變發(fā)生，但這并不能排除包含miRNA機制在內(nèi)的一些表觀遺傳學(xué)機制參與CDK4對脈絡(luò)膜黑色素瘤發(fā)生發(fā)展調(diào)節(jié)的可能性。

圖5 流式細胞術(shù)檢測miR-15b-5p對脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞周期的影響Fig.5 The effect of miR-15b-5p on the cell cycle of choroidal melanoma cells detected by flow cytometry

miRNA是一類長約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，其功能是與靶基因mRNA的3’UTRs互補性結(jié)合，從而反向調(diào)控靶基因的表達。目前發(fā)現(xiàn)異常的miRNA表達與包括癌癥在內(nèi)的許多疾病有關(guān)，而功能實驗顯示miRNA既可以作為抑癌基因，也可作為癌基因發(fā)揮作用［11］。研究［12-13］表明，miRNAs在脈絡(luò)膜黑色素瘤患者的血清、玻璃體和腫瘤標本中都存在異常表達，許多miRNAs的生物學(xué)作用也進一步被驗證［14-16］。因而miRNAs在脈絡(luò)膜黑色素瘤進程中起著重要的作用。

本研究將人眼侵襲性脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞系作為研究對象，通過體外實驗探討miR-15b-5p靶向CDK4抑制脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞增殖的作用。雙熒光素酶報告實驗證明，CDK4是miR-15b-5p的直接靶點。在脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞系MUM-2B中轉(zhuǎn)染4組miRNA （nc，miR-15b-5p mimics，inhibitor nc，miR-15b-5p inhibitor） ，實時熒光定量PCR結(jié)果證實轉(zhuǎn)染有效，Western blotting結(jié)果證明miR-15b-5p能夠負向調(diào)節(jié)CDK4的蛋白表達。上述結(jié)果共同證明在脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞系中miR-15b-5p能夠靶向抑制CDK4的表達。應(yīng)用CCK-8進一步對細胞增殖能力進行檢測，結(jié)果表明miR-15b-5p能夠抑制脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞增殖。流式細胞術(shù)結(jié)果證明，miR-15b-5p能夠造成脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞發(fā)生G1期阻滯。這一結(jié)果與p16-cyclinD-CDK4/6-RB通路主要在G1期發(fā)揮作用的理論一致。以上結(jié)果共同證明了miR-15b-5p能夠通過調(diào)節(jié)CDK4的表達，抑制p16-cyclinD-CDK4/6-RB通路，進而抑制脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞增殖。

miR-15b-5p已被報道與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但其發(fā)揮的生物學(xué)功能卻不盡相同。一方面，miR-15b-5p作為腫瘤的抑制因子發(fā)揮著多種作用，如誘導(dǎo)細胞死亡、抑制增殖、拮抗轉(zhuǎn)移、重新調(diào)節(jié)代謝、破壞染色體穩(wěn)定性、誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)炎癥等［17-18］。另一方面，miR-15b-5p又扮演促癌角色，與皮膚黑色素瘤的發(fā)生和不良預(yù)后相關(guān)［19］，且復(fù)發(fā)患者的血清miR-15b-5p的水平隨時間顯著升高［20］。miRNA在腫瘤中的具體作用與其靶基因密切相關(guān)，即使相同的miRNA作用于不同的靶基因也有可能呈現(xiàn)出完全不同的生物學(xué)功能。雖然脈絡(luò)膜黑色素瘤與皮膚黑色素瘤有許多相似之處，但其中深入的發(fā)生發(fā)展機制仍有可能存在巨大的差別。本研究證明miR-15b-5p在脈絡(luò)膜黑色素瘤中通過調(diào)控CDK4的表達而發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-15b-5p可靶向調(diào)節(jié)CDK4在脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞系MUM-2B細胞中的表達，從而抑制脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的生長。為探索脈絡(luò)膜黑色素瘤的分子治療靶點提供了實驗依據(jù)，為脈絡(luò)膜黑色素瘤的治療提供了一種新的可能。