徐向輝 趙忠 趙國棟 盛金鑫

江蘇省海門市人民醫(yī)院普外科，海門 226100

Krǜppel樣因子4(Krǜppel-like factor4, KLF4)是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，在C端包含3個連續(xù)的C2H2結(jié)構(gòu)域[1]，能夠調(diào)控多種癌基因、抑癌基因的信號通路，在腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種病理過程中發(fā)揮作用[2-3]。研究表明KLF4在食管癌、結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用[4-6]，而在乳腺癌、前列腺癌等腫瘤中發(fā)揮癌基因的作用[7-8]。KLF4在胰腺癌中的作用尚不十分明確。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程，已被證實在惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用[9-10]。Li等[11]報道，肝癌組織表達的KLF4能夠直接抑制slug、Zeb1等因子的表達，進而抑制EMT和肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究通過下調(diào)胰腺癌細胞PANC1 KLF4的表達，探討其在胰腺癌EMT和侵襲中的作用。

材料與方法

一、胰腺組織KLF4表達檢測

胰腺癌組織芯片購于美國BioMax公司，包含胰腺癌組織70例和10例匹配的胰腺正常組織。采用免疫組織化學染色法檢測芯片中組織的KLF4蛋白表達。兔抗人KLF4多克隆抗體及鼠抗兔IgG均購于美國Santa Cruz公司。最后DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片，由2位副高職病理科醫(yī)師顯微鏡下閱片并評分。染色強度：無染色為0分，淺棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分；陽性細胞百分比：<10%為0分，10%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分；兩得分相乘，≤3分為陰性，3～≤6分為弱陽性，>6分為強陽性。

二、細胞培養(yǎng)和質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

胰腺癌細胞PANC1購于中國科學院細胞庫(上海)，常規(guī)培養(yǎng)傳代。設計針對KLF4的小發(fā)卡RNA(shKLF4)：正義鏈為5′-GACCAGGCACUACCGUAAAdTdT-3′，反義鏈為3′-dTdTCUGGUCCGUGAUGGCAUUU-5′。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。采用酶切法將引物插入質(zhì)粒pGL-4.27，采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期PANC1細胞，為shKLF4組，以轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的細胞為陰性對照組，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞為空白對照(mock)組。

三、KLF4、E-cadherin、vimentin mRNA表達檢測

收集對數(shù)生長期PANC1細胞，采用Trizol(Invitrogen公司)提取細胞總RNA。采用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(日本TaKaRa公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。采用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) 試劑盒(日本TaKaRa公司)進行實時熒光定量PCR，反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40次循環(huán)。由儀器自帶軟件獲取Ct值，按公式2-△△CT計算目的基因mRNA表達量。

四、KLF4、E-cadherin、vimentin蛋白表達檢測

收集對數(shù)生長期PANC1細胞，加適量RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF置于冰上裂解30 min，離心取上清。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)定量蛋白的濃度后取30 μg常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達，以GAPDH作為內(nèi)參?？筀LF4、E-cadherin、vimentin抗體均購于美國Santa Cruz公司，最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。采用凝膠圖像軟件分析系統(tǒng)掃描。采用Image J軟件分析掃描圖像,以目的基因條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比為蛋白相對表達量。

五、細胞遷移能力檢測

先將6孔板底部用標記筆劃3條水平線作為拍照標記，然后取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，每孔1×106個細胞，每組設3個復孔。待細胞融合度達到90%時棄去培養(yǎng)基，用20 μl槍頭在孔中間垂直于水平線劃一條橫線，PBS沖洗后加無血清DMEM培養(yǎng)基2 ml。于劃線后即刻和培養(yǎng)16 h時分別拍照并觀察各組細胞橫向遷移距離。劃線后0 h劃痕寬度設為A，12 h劃痕寬度設為B，A-B/A×100%則為劃痕愈合百分比。

六、細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力檢測

采用美國Corning公司的帶有8 μm小孔的Transwell小室及美國BD公司的Matrigel基質(zhì)膠檢測。侵襲實驗前先將Matrigel基質(zhì)膠置于4℃過夜融化，第二天將融化的基質(zhì)膠用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋6倍(冰上操作)，從上室加入100 μl此混合液，37℃孵育4 h后使用。取對數(shù)生長期細胞200 μl(20 000個細胞)鋪于上室，下室加600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)16 h后取出小室，PBS洗3遍后用棉簽擦去上室未穿膜細胞，用4%多聚甲醛固定20 min，然后用結(jié)晶紫染色30 min，晾干后置于顯微鏡下，每個小室隨機取5個視野并計數(shù)穿膜細胞數(shù)，取均值。

七、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、胰腺癌和正常胰腺組織KLF4的表達

KLF4表達在細胞質(zhì)和細胞核(圖1)。胰腺癌組織的陽性表達率為47.1%，正常胰腺組織陽性表達率為80.0%。KLF4表達與胰腺癌分化、病理分期和遠處轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)(表1)。

圖1 胰腺組織中KLF4陰性(1A)、弱陽性(1B)、強陽性(1C)表達

表1胰腺癌組織KLF4表達與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

變量例數(shù)KLF4表達陰性弱陽性強陽性χ2值P值年齡(歲) <4582(25.0)3(37.5)3(37.5)1.30.5 ≥456218(29.0)32(51.6)12(19.3)性別 男4511(29.0)24(53.3)10(22.2)5.10.08 女2512(48.0)7(28.0)6(24.0)腫瘤分化 Ⅰ期和Ⅱ期5120(39.2)19(37.3)12(23.5)12.800.002 Ⅲ期1915(78.9)4(21.1)0UICC分期 Ⅰ期和Ⅱ期6131(50.8)19(31.1)11(18.1)6.140.047 Ⅲ期和Ⅳ期97(77.8)2(22.2)0遠處轉(zhuǎn)移 有33(100.0)0073.10.000 無6734(52.2)21(31.3)12(16.5)

二、KLF4、E-cadherin、vimentin基因表達的變化

mock組、對照組、shKLF4組PANC1細胞的KLF4 mRNA和蛋白表達量分別為1.01±0.18、1.02±0.20、0.22±0.06和1.01±0.08、1.20±0.16、0.24±0.02；上皮型標志物E-cadherin mRNA和蛋白表達量為1.01±0.18、1.03±0.19、0.20±0.10和0.96±0.11、1.26±0.11、0.36±0.06；間質(zhì)型標志物vimentin mRNA及蛋白表達量為1.00±0.15、1.01±0.14、2.91±0.21和0.12±0.05、0.08±0.02、1.18±0.18。shKLF4組的KLF4基因表達顯著下調(diào)(F=24.95，P=0.0012；F=77.37，P<0.0001)，E-cadherin基因表達也顯著下調(diào)(F=25.71，P=0.0011；F=67.99，P<0.0001)，而vimentin基因表達顯著上調(diào)(F=126.30，P<0.0001；F=99.23，P<0.0001，圖2)，差異均有統(tǒng)計學意義。mock組與對照組的差異均無統(tǒng)計學意義。PANC1細胞形態(tài)也由上皮型向間質(zhì)型發(fā)生轉(zhuǎn)變(圖3)。

圖2 mock組(1)、對照組(2)、shKLF4組(3)PANC1細胞的KLF4、E-cadherin、vimentin蛋白表達

圖3 mock組(3A)、對照組(3B)、shKLF4組(3C)PANC1細胞的形態(tài)變化

三、PANC1細胞遷移和侵襲能力的變化

mock組、對照組、shKLF4組細胞的劃痕愈合能力分別為(11±2)%、(10±1)%、(21±3)%；遷移實驗的穿膜細胞數(shù)為(96±13)、(88±12)、(215±23)個細胞/40倍視野；侵襲實驗的穿膜細胞數(shù)為(101±14)、(92±13)、(179±18)個細胞/40倍視野。shKLF4組細胞的劃痕愈合(F=47.82，P<0.001，圖4)、遷移(F=53.68，P=0.0001，圖5)和侵襲(F=27.65，P=0.0009，圖6)能力均顯著增強，差異均有統(tǒng)計學意義，而mock組與對照組的差異均無統(tǒng)計學意義。

圖4 mock組(4A、4B)、對照組(4C、4D)、shKLF4組(4E、4F)PANC1細胞的劃痕愈合能力

討 論

KLF4是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[12-13]。KLF4在胃癌中通過轉(zhuǎn)錄抑制β-catenin的表達而抑制胃癌細胞生長增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[14]。在結(jié)腸癌中KLF4的表達較結(jié)腸正常組織表達明顯下降，且KLF4表達量越高，結(jié)腸癌復發(fā)率越低、生存期越長[15]。已有研究表明，KLF4在黑色素瘤和前列腺癌中發(fā)揮促癌的作用。Shi等[16]研究表明KLF4在胰腺癌中表達降低，且通過抑制KLF4的表達降低胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。Guo等[17]亦發(fā)現(xiàn)KLF4在胰腺癌中通過抑制MSI2的表達降低胰腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移能力。本研究分析了KLF4在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達，并探索KLF4對胰腺癌EMT和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示KLF4在胰腺癌組織中表達量明顯低于胰腺正常組織；KLF4表達與腫瘤分化、病理分期和遠處轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)；下調(diào)KLF4表達后胰腺癌體外侵襲轉(zhuǎn)移能力增強。本研究結(jié)果表明KLF4在胰腺癌中發(fā)揮抑癌作用，能夠抑制胰腺癌細胞體外侵襲能力。

眾所周知，EMT在腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[18]。已有研究發(fā)現(xiàn)多種因子參與腫瘤EMT的調(diào)控，如Smad4、Cav-1、ZEB-1等。然而，關(guān)于KLF4在胰腺癌EMT和侵襲中的作用尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PANC1細胞中KLF4的表達后，EMT上皮型標志物E-cadherin的mRNA和蛋白水平均降低，而間質(zhì)型標志物vimentin的mRNA和蛋白水平均升高，且PANC1細胞形態(tài)由上皮型向間質(zhì)型發(fā)生轉(zhuǎn)變。表明KLF4能夠通過促進E-cadherin的表達和抑制vimentin的表達而抑制EMT發(fā)生。最近，亦有報道稱KLF4能夠通過轉(zhuǎn)錄激活肝細胞核因子-6的表達而抑制肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。此外，KLF4的表達也能夠被多種非編碼RNA調(diào)控，如miR-32[20]、miR-152[21]等。因此，KLF4在胰腺癌中發(fā)揮抑癌作用的調(diào)控機制及各因子之間的相互作用還有待于深入研究。

圖5 mock組(5A)、對照組(5B)、shKLF4組(5C)PANC1細胞的遷移能力 圖6 mock組(6A)、對照組(6B)、shKLF4組(6C)PANC1細胞的侵襲能力

綜上所述，KLF4在胰腺癌進展中發(fā)揮抑癌作用，通過抑制EMT而降低胰腺癌細胞體外侵襲能力，靶向調(diào)控KLF4表達可能為胰腺癌防治提供新的思路。

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