劉 鴻，王 春

(1.新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學研究所，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，新疆 烏魯木齊 830000；2.上海海洋大學，上海 201306)

中華沙塘鱧(Odontobutissinensis)隸屬鰕虎魚亞目(Gobioidei)、塘鱧科(Eleotridae)，沙塘鱧屬(Odontobutis)，又名沙烏鱧。體粗壯，頭大而闊，稍扁平，腹部渾圓，后部側(cè)扁。鰭兩個，各鰭無硬棘。胸鰭大，圓形，尾鰭后緣稍圓，無側(cè)線。體呈黑褐色，腹部淡黃，體側(cè)有不規(guī)則的大塊黑色斑紋，各鰭均具有淡黃色與黑色相間的條紋，其魚卵具黏著絲，屬黏性卵[1-2]。沙塘鱧屬魚類為東亞特有的淡水小型肉食性魚類，因其肉質(zhì)緊實無細刺，近幾年來成為長江中下游一帶的暢銷經(jīng)濟魚類，已成為中華絨螯蟹池塘養(yǎng)殖主要的混養(yǎng)對象。近年來有關(guān)中華沙塘鱧的研究相對較多，主要以分子生物學[3]、年齡生長[4]、種群分布[5]、人工繁育[6]及生物多樣性[7]等研究為主。

隨著掃描電子顯微鏡技術(shù)、生物樣品制備以及脫水干燥等技術(shù)的成熟，掃描電子顯微鏡在生物學方面得到了較為廣闊的應(yīng)用。當前國內(nèi)外對鰕虎魚亞目魚類行為學研究以及精子入卵掃描電鏡觀察都有較多報道[8-13]，但有關(guān)黏性卵精子入卵機制研究相對較少。Giulianini等[14]研究證明鰕虎魚精子可完全穿過成熟魚卵的黏著絲，解釋了成熟卵細胞對于精子的選擇機制。2009年何振邦[11]等對中華烏塘鱧精子入卵的整個過程加以捕捉并描述，討論了單精入卵機制，對卵膜孔區(qū)的嵴狀突起加以討論。2014年曹晉飛[4]對中華沙塘鱧胚胎發(fā)育予以研究，獲得不同發(fā)育階段所需時間及有效積溫。文章旨在通過對中華沙塘鱧受精過程的觀察，探究該魚的繁殖行為，以期提高人工繁育孵化率。

1 材料和方法

本實驗所采樣品均為野生中華沙塘鱧，捕獲之后在暫養(yǎng)池暫養(yǎng)。本次試驗采樣總計兩次，選擇已達性成熟的雌雄個體共約300尾，雌雄比例2∶1，雌魚平均體重為35.7 g，雄魚平均體重32.4 g。中華沙塘鱧每年4月下旬性腺開始發(fā)育，繁殖期為5月上旬，水溫15～20℃。在性腺發(fā)育成熟之后，提前16 h按個體體重注射絨毛膜促性腺激素(HCG)和促黃體素激素(LRH—A2)，注射濃度按體重計量[15-17]。

催產(chǎn)后采用人工濕法授精。輕壓魚腹獲取成熟生殖細胞，用生理鹽水將精子稀釋后以羽毛攪拌將其與成熟卵細胞均勻混合。授精后分別從5 s開始直至1 min，間隔5 s取受精卵固定，1 min后間隔30 s，所固定最長受精時間為5 min，每次固定卵子80～120粒。

樣品用磷酸戊二醛溶液固定，其中戊二醛濃度為2.5%。樣品固定之后采用逐級酒精脫水，乙醇濃度梯度分別為30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%，各級酒精脫水時間為10 min，之后保存于乙酸甲酯中，用以置換出乙醇[18]。

將處理之后的樣品置于二氧化碳臨界干燥裝置中干燥，取出后用解剖針、解剖刀、鑷子以及手術(shù)剪在體視顯微鏡下去除黏著絲，并固定在掃描電鏡樣品臺的導(dǎo)電膠上，噴金之后觀察。

2 結(jié)果

2.1 精子的外部形態(tài)

中華沙塘鱧的精子由頭部、頸部、體部和尾部4部分組成，全長20～25 μm。頭部橢圓形，2.25±0.25 μm，短軸1.00±0.20 μm。頸部較短，頸部之后為體部，長度約為1.5 μm左右。體部之后為精子的尾部，可分為前、中、后三部分，尾部的總長為19.0±1.0 μm(圖1)。

圖1 中華沙塘鱧精子(a:放大倍數(shù)3000;b:放大倍數(shù)5000)

2.2 成熟卵子的外部形態(tài)

中華沙塘鱧的成熟卵呈鮮艷黃色，為圓球形，卵子直徑為1.30±0.02 mm。黏著器位于卵子動物極一端，由基底、篩網(wǎng)和黏著絲三部分組成。揭開成熟卵子的卵膜，觀察卵核內(nèi)部結(jié)構(gòu)，掃描電鏡下卵核的表面為突起的小顆粒，不平坦。卵膜厚度11.8±0.8 μm。中華沙塘鱧成熟魚卵黏著絲長度可達575.0±25.0 μm，篩狀圓柱高度為50.0±3.0 μm。粘著器底層篩孔數(shù)量為每周80左右，上層數(shù)目較多。底層篩孔最大，從下往上篩孔直徑逐漸減小，有5～6層。底層篩孔外徑約7.5±2.5 μm，高度10 μm左右，上層篩孔大小不一，篩孔長度可達20 μm以上，寬度5.5±0.5 μm。中華沙塘鱧成熟卵膜表面有嵴狀突起，將成熟中華沙塘鱧黏著絲剔除可觀察到卵膜孔區(qū)，黏著絲內(nèi)部卵膜平滑，無隆起的嵴，其正中為受精孔，卵膜孔區(qū)直徑為172.5±2.5 μm，受精孔為橢圓形，長徑為7.2±0.2 μm，短徑4.5±0.2 μm(圖2)。

2.3 精子入卵過程

對固定的中華沙塘鱧受精卵觀察可知，中華沙塘鱧精子入卵過程為：精子通過成熟卵細胞近動物極篩柵底層篩孔，進而到達受精孔，單個精子入卵后受精孔關(guān)閉，外部精子隨即降解，卵細胞進入胚胎期(圖3)。

2.3.1 中華沙塘鱧成熟卵細胞授精5 s 中華沙塘鱧成熟卵細胞授精5 s，精子主要集中于卵細胞黏著絲下卵膜表面，500倍鏡下可觀察到篩網(wǎng)孔前聚集的大量精子，在掃描電鏡(SEM)下能夠清楚地看到其外部形態(tài)。

2.3.2 中華沙塘鱧成熟卵細胞授精15 s 中華沙塘鱧成熟卵細胞授精15 s，大量精子開始進入篩網(wǎng)孔，準備穿過篩網(wǎng)，4 000倍鏡下，可觀察到篩孔外部大量的精子尾部，表明已有精子進入篩網(wǎng)孔，且精子在進入篩網(wǎng)孔時已經(jīng)開始相互競爭。

2.3.3 中華沙塘鱧成熟卵細胞授精20 s 中華沙塘鱧授精20 s，大量精子已進入黏著器底部篩網(wǎng)孔，篩網(wǎng)外部僅剩余少量精子，且成熟卵細表面開始出現(xiàn)絮狀物。

2.3.4 中華沙塘鱧成熟卵細胞授精25 s 去除中華沙塘鱧受精卵黏著器底部黏著絲觀察發(fā)現(xiàn)，中華沙塘鱧授精25 s，精子正處于穿過篩網(wǎng)孔階段，在篩網(wǎng)孔橫截面上可以看到大量的精子，并有少量絮狀物產(chǎn)生。

2.3.5 中華沙塘鱧成熟卵細胞授精55 s 授精55 s，大量精子完全穿過篩網(wǎng)孔，進入卵膜孔區(qū)，但部分精子進入卵膜孔區(qū)后會反向游動，甚至游離卵膜孔區(qū)。

2.3.6 中華沙塘鱧成熟卵細胞授精60 s 在中華沙塘鱧成熟卵授精60 s，受精孔內(nèi)已有精子進入，同時受精孔外的精子已經(jīng)開始解體，解體從精子的尾部開始，直至頭部后完全解體。

2.3.7 中華沙塘鱧成熟卵細胞授精120 s 中華沙塘鱧成熟卵細胞授精120 s，精子進入受精孔，隨后受精孔關(guān)閉，卵膜孔區(qū)不再平整，受精卵表面精子加速解體。之后成熟卵完成受精過程，吸水后進入胚胎發(fā)育階段。

圖2 中華沙塘鱧成熟卵子結(jié)構(gòu)

3 討論

3.1 中華沙塘鱧生殖細胞結(jié)構(gòu)及功能

中華沙塘鱧卵為黏性卵，當卵子成熟后雌性將魚卵產(chǎn)于水中，成熟卵細胞遇水立即產(chǎn)生黏性，卵細胞下端黏著絲具有極強的黏附能力，能穩(wěn)固的將卵細胞黏連于基質(zhì)之上，成熟雌性排卵后在整個受精以及發(fā)育過程中都能牢固附著于底質(zhì)，有助于提高受精率和孵化率。分析認為，黏著絲附著于雄性精子軌跡有助于保持卵膜孔區(qū)清潔，提高受精率[11]。就生殖細胞結(jié)構(gòu)而言，中華沙塘鱧成熟精子與中華烏塘鱧精子區(qū)別較大。中華烏塘鱧(Bostrichthyssinensis)成熟精子頭部為圓形[11]，而中華沙塘鱧精子頭部為橢圓形，且中華沙塘鱧精子較中華烏塘鱧精子頭部以及尾部大。但中華沙塘鱧與中華烏塘鱧成熟卵細胞的大小相近、結(jié)構(gòu)相似，黏著絲、卵膜厚度以及篩孔大小及長度相差不大。主要的區(qū)別在于卵膜孔區(qū)結(jié)構(gòu)，中華沙塘鱧卵膜孔區(qū)較為平整，無隆起的嵴存在，而中華烏塘鱧卵膜孔區(qū)有12～16條由基地隆起而形成的嵴狀結(jié)構(gòu)，以受精孔為中心呈輻射狀分布，稱為輻射嵴，且個輻射嵴組成若干個扇形區(qū)(圖4)[11]。

3.2 中華沙塘鱧繁殖行為學與生殖細胞結(jié)構(gòu)關(guān)系

與草鰕虎魚(Zosterisessorophiocephalus)繁殖行為學相似，中華沙塘鱧繁殖前由雄魚率先產(chǎn)出精子軌跡，繼而雌魚釋放成熟卵細胞并附著于產(chǎn)卵基質(zhì)，精子激活后開始游動并使卵細胞受精[19]。2000年Giulianini等通過使用掃描電鏡對鰕虎魚精子入卵的過程予以觀察，證實了精子完全可以通過黏著絲成功到達受精孔[20]，與本文研究結(jié)果相符。黏著絲對成熟卵細胞準確受精不僅不會差生阻礙，而且能夠保證整齊黏附于同一基質(zhì)的大量魚卵同時受精，進而有效降低精子進入卵細胞的能量消耗。

圖3 中華沙塘鱧精子入卵過程

圖4 中華烏塘鱧生殖細胞結(jié)構(gòu)