鐘曉璇，顏菲菲，曲 奕，陳鈺涵，李新顏，邱振魯

(齊魯理工學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200)

在自然界的水域生態(tài)系統(tǒng)中，藻類是水域食物鏈的初級生產(chǎn)者，它們的生命活動，能影響和改變水的理化性質(zhì)[1]。藻類的生長狀況往往能指示水體富營養(yǎng)化程度，在富營養(yǎng)化的水體中，藻類及浮游生物大量繁殖，水體溶解氧量降低，水質(zhì)惡化[2]。富營養(yǎng)化已經(jīng)成為我國湖泊所面臨的主要生態(tài)環(huán)境問題之一。小球藻是一種淡水湖泊中常見的藻類，并且作為漁業(yè)生產(chǎn)常用藻，因其強(qiáng)大的光合作用和易于消化的特性，在魚、蝦、蟹、貝的養(yǎng)殖過程中起著很好的肥水和調(diào)水的作用[3]。小球藻富含蛋白質(zhì)、維生素、生物多糖、不飽和脂肪酸、葉綠素、類胡蘿卜素等，已被利用作為魚、蝦、蟹良好的開口餌料，研究表明小球藻對營養(yǎng)物質(zhì)具有較強(qiáng)的吸收能力，并且能夠降解水中氨氮、硫化氫亞硝酸鹽等有毒害物質(zhì)，對改善水質(zhì)起著重要作用[4-5]。但同時也要注意小球藻的添加量，如果添加過多會導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，導(dǎo)致魚類大量死亡，對漁業(yè)造成損失。研究并控制其生長條件，既可以為通過小球藻生長狀況監(jiān)測湖泊、池塘、魚缸的富營養(yǎng)化程度提供依據(jù)，也可以為開發(fā)利用小球藻資源，給養(yǎng)殖魚類提供更多高營養(yǎng)價值的餌料提供可依靠的參考[6]。

關(guān)于小球藻生長條件的研究，已見較多報道，例如陳家長[7]等報道了pH對魚腥藻和普通小球藻競爭的影響，表明pH 9.0為兩種藻類生長的最適pH。徐慧等[8]研究了光照強(qiáng)度對小球藻生長的影響，其研究結(jié)果為5 500 lx光照強(qiáng)度是小球藻生長最適光強(qiáng)。然而黃亮[9]的研究報告了小球藻在500 lx和1 000 lx光強(qiáng)下最終都能達(dá)到最大生物量，差異并不大。這與徐慧等報道結(jié)論不符，可能是由于二者的研究范圍一個在低強(qiáng)度光照范圍，一個在高強(qiáng)度光照范圍所造成的。

影響藻類生長的因素很多，除了環(huán)境因素外還有各種操作條件，可變因素較多[10-12]。因此，微生物培養(yǎng)條件的優(yōu)化工作就顯得非常重要。響應(yīng)面法(Response Surface Method) 即響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方法，是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法。該方法試驗(yàn)次數(shù)少、周期短，能夠研究幾個因素間交互作用，求得的因素與響應(yīng)值間二次回歸方程精確度高，是優(yōu)化工藝條件、降低生產(chǎn)成本、解決科學(xué)研究和生產(chǎn)過程中實(shí)際問題的一種有效辦法[13]。目前還未見關(guān)于小球藻生長條件的響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化的相關(guān)報道。

本實(shí)驗(yàn)選取溫度、pH、磷酸鹽濃度三個因素，通過響應(yīng)面法研究它們之間的交互作用對小球藻生長的影響，并通過軟件優(yōu)化小球藻生物量最佳生長條件，以期為小球藻用于水體富營養(yǎng)化的監(jiān)測及小球藻資源的充分利用提供可靠的數(shù)據(jù)參考。同時也希望為進(jìn)一步研究水體中各種藻類的群落結(jié)構(gòu)提供一些初步的材料。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)器材

高壓蒸汽滅菌鍋；超凈工作臺；752型分光光度計(jì)；恒溫?fù)u床；光照培養(yǎng)箱；各種玻璃儀器。

1.2 材料

1.2.1 藻種 蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻。

1.2.2 培養(yǎng)基 M-11培養(yǎng)基：NaNO3100 mg/L；K2HPO410 mg/L；MgSO4·7H2O 75 mg/L；Na2CO320 mg/L；檸檬酸鐵6 mg/L；EDTA-Na2·2H2O 1 mg/L；CaCl2·2H2O 40 mg/L；pH 8.0[4]。

滅菌條件：所有培養(yǎng)基經(jīng)121℃，滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 光照培養(yǎng) 將小球藻接種于M-11培養(yǎng)基中，30 ℃、100 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h制成接種液，取1 mL接種液接種到響應(yīng)面法設(shè)計(jì)的不同條件的培養(yǎng)基中，按照設(shè)置條件，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光強(qiáng)度設(shè)置為5 500 lx，調(diào)整各培養(yǎng)瓶位置使每瓶接受的光強(qiáng)度相同，每個條件培養(yǎng)3瓶，測定數(shù)據(jù)取平均值

1.3.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)使用Expert 8.0.6的Box-Behnken Design法進(jìn)行設(shè)計(jì)，選取溫度、pH、磷濃度作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的考察因素(自變量)，以+1、0、-1分別表示自變量的高、中、低水平，以培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)液OD680作為響應(yīng)值。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1.3.3 藻類生物量的測定 藻類生長量的測定采用分光光度法，以A680計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 二次回歸模型擬合及方差分析

按照1.3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用DesignExpert分析軟件對表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元擬合分析，得到蛋白核小球藻生物量(Y) 對溫度A、pH值B以及磷酸鹽含量C的二次多項(xiàng)回歸方程模型為:

Y=0.11+5.708×10-3×A+4.812×10-3×B+1.146×10-3×C+0.012×A×B-2.042×10-3×A×C-3.250×10-3×B×C-0.013×A2-0.033×B2-0.017×C2

回歸方程中回歸系數(shù)的估計(jì)值見表3，回歸方程的方差分析及模型可信度分析結(jié)果見表4-表6。

表3 系數(shù)估計(jì)

表5 模型可信度分析

由表3、表4可知，模型(P<0.01)具有顯著性，模型選擇正確。

表4 回歸方程的方差分析

注：P<0.01表示影響極顯著，P<0.05表示影響顯著。

2.2 響應(yīng)面與最佳發(fā)酵條件確定

根據(jù)回歸方程，及響應(yīng)曲面圖，考察所擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析溫度、pH、碳氮比對生物量的影響。響應(yīng)曲面立體分析圖及其等高線圖見圖1-圖3。

圖1 響應(yīng)面立體分析圖及相應(yīng)等高圖

由圖1可見，2個因素交互項(xiàng)顯著。pH不變時，隨溫度的升高，小球藻生物量有增加趨勢，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過25 ℃時，小球藻生物量降低。溫度在24～25 ℃，pH在7.0左右，小球藻生物量較多高。溫度對小球藻生長發(fā)育的影響很大，藻類的最適宜溫度在25 ℃左右。與郭艷琴[9]的研究結(jié)論相符。其研究表明，藻類在高于30 ℃和低于4 ℃下幾乎不生長，在15 ℃～25 ℃下，均具有明顯的指數(shù)生長期，隨著溫度的升高，藻類比增殖速率增大，25 ℃更適合藻類的生長、繁殖。

圖2 響應(yīng)面立體分析圖及相應(yīng)等高圖

由圖2可見，2個因素的交互項(xiàng)不顯著。溫度不變時，隨磷酸鹽濃度的增加，小球藻生物量呈先降低后升高。溫度在25 ℃，磷酸鹽濃度5.5 mg/L附近時，生物量較高。

圖3 響應(yīng)面立體分析圖及相應(yīng)等高圖

由圖3可見，2個因素的交互項(xiàng)不顯著。磷酸鹽濃度不變時，隨pH的增加，藻類生物量先升高后降低，當(dāng)pH超過7.0時，小球藻生物量呈逐步降低趨勢。pH過高或過低均會對藻類生長及性能的發(fā)揮產(chǎn)生影響。pH為中性條件最有利于藻類生長及性能的發(fā)揮。

從圖中及軟件分析，回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)是極大值點(diǎn)，即溫度26.43 ℃、pH為7.25、磷酸鹽濃度5.51 mg/L時，此時小球藻生物量最高，達(dá)到0.115?？紤]到實(shí)際操作的條件，將小球藻最佳生長條件修正為26.4 ℃、pH為7.25、磷酸鹽濃度為5.50 mg/L。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將藻類接種于M-11培養(yǎng)基中，使用修正后的優(yōu)化條件培養(yǎng)48 h，小球藻平均生物量達(dá)到了0.116，與軟件預(yù)測值無顯著差別，但比優(yōu)化前的最佳條件略有提高。

3 結(jié)論

研究用響應(yīng)面法優(yōu)化小球藻生長的最佳工藝條件，建立的小球藻生物量的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型具有顯著性，其校正決定系數(shù)R2=0.9598，優(yōu)化后藻類生長的最佳工藝條件為溫度26.4 ℃、pH為7.25、磷酸鹽濃度為5.50 mg/L，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)檢測，生物量由0.114提高到了0.116，與預(yù)測值無顯著差別。因此響應(yīng)面法優(yōu)化得到的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用意義。