劉夢(mèng)婷 張?zhí)旌?張碩影 云中燕 孟琪

Usher綜合征是一組以視網(wǎng)膜色素變性及不同程度的聽(tīng)力障礙為主要特征的常染色體隱性遺傳性疾病[1]，一些患者還伴有前庭功能障礙的表現(xiàn)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，不同人群中，Usher綜合征的發(fā)病率大約在3.3～16.6/100000[2～4]。根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度將Usher綜合征分為三型[5]。I型患者癥狀最重，主要表現(xiàn)為先天性重度到極重度感音神經(jīng)性聾，前庭功能障礙，視網(wǎng)膜色素變性發(fā)生較早，一般在10歲左右發(fā)生。II型患者表現(xiàn)為先天性中度到重度感音神經(jīng)性聾，前庭功能正常，視網(wǎng)膜色素變性發(fā)生較I型晚，通常在青春期發(fā)生[6]。III型通常表現(xiàn)為語(yǔ)后聾，逐漸加重的聽(tīng)力損失及前庭功能障礙，視網(wǎng)膜色素變性發(fā)生時(shí)間較晚，通常在20歲左右[7]。

Usher綜合征遺傳異質(zhì)性較高，目前已定位14個(gè)相關(guān)基因組區(qū)間，發(fā)現(xiàn)致病基因10個(gè)。其中I型相關(guān)位點(diǎn)有9個(gè)，分別為USH1B-K。明確致病基因6個(gè)，分別為MYO7A、USH1C、CDH23、PCDH15、SANS和CIB2，其中MYO7A基因突變?cè)赨sher綜合征I型中最為常見(jiàn)，約占53.2%[8]。本研究通過(guò)全外顯子捕獲測(cè)序技術(shù)結(jié)合軟件分析和Sanger驗(yàn)證，在一個(gè)Usher綜合征家系中發(fā)現(xiàn)了MYO7A基因復(fù)合雜合突變c.3412C＞T(p.Q1138*)、c.4152G＞C (p.K1384N)，這兩個(gè)突變位點(diǎn)在既往的文獻(xiàn)中均未見(jiàn)報(bào)道，本研究拓展了MYO7A基因的突變譜。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

先證者為10歲女童，新生兒聽(tīng)力篩查初篩及復(fù)篩均未通過(guò)，3個(gè)月時(shí)于哈爾濱兒童醫(yī)院行聲導(dǎo)抗檢查，結(jié)果為A型曲線。行聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）檢測(cè)，各給聲強(qiáng)度V波均未引出。行多頻穩(wěn)態(tài)（ASSR）檢查，雙耳平均聽(tīng)閾均為100 dB HL，最終診斷為極重度感音神經(jīng)性聾?；純河?歲時(shí)行左側(cè)人工耳蝸植入術(shù)。5歲時(shí)出現(xiàn)夜盲并逐漸加重，視野縮小，視力下降。7歲時(shí)于我院眼科就診，行視力、眼底視野視網(wǎng)膜電圖等相關(guān)檢查。裸眼視力左眼0.3，右眼0.3。眼底檢查顯示視乳頭變黃，視網(wǎng)膜血管狹窄，骨針樣色素細(xì)胞沉積和斑點(diǎn)。視野檢查顯示環(huán)形缺損。視網(wǎng)膜電圖顯示各種閃光強(qiáng)度檢查均為熄滅型。診斷為視網(wǎng)膜色素變性。先證者伴有前庭功能減退的證據(jù)，如20個(gè)月才學(xué)會(huì)走路，較正常兒童晚。根據(jù)先證者典型的臨床表現(xiàn)，初步診斷為Usher綜合征I型。對(duì)患兒一級(jí)親屬進(jìn)行詳細(xì)的體格檢查，其父母無(wú)相似臨床表現(xiàn)。（圖1）

圖1 家系譜圖

1.2 研究方法

本研究遵循赫爾辛基宣言，經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在獲得患者及其家屬知情同意后，采集先證者及其父母靜脈血3 mL(EDTA 抗凝血) 并進(jìn)行致病基因突變分析。首先，對(duì)先證者進(jìn)行基因全外顯子及剪切位點(diǎn)測(cè)序，方法如下：(1)基因組DNA 提取：使用血液基因組DNA提取試劑盒，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(2)靶向捕獲二代測(cè)序：針對(duì)基因組外顯子區(qū)域采用安捷倫V6基因組外顯子區(qū)域定制捕獲探針進(jìn)行目標(biāo)基因全外顯子捕獲測(cè)序：①文庫(kù)構(gòu)建：首先使用非接觸式超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)打斷基因組DNA使其片段化至約150～200 bp，然后使用Kapa末端修復(fù)酶進(jìn)行末端修復(fù)，將修復(fù)后的DNA使用AMPure磁珠進(jìn)行純化，并使用kapaA-tailing試劑在DNA 3′端添加A堿基，再使用KAPA DNA Ligase將Adapter連接到DNA片段上，最后進(jìn)行文庫(kù)模板量平衡的線性擴(kuò)增，完成文庫(kù)制備；②雜交捕獲：真空濃縮DNA文庫(kù)樣本進(jìn)行雜交捕獲，PCR產(chǎn)物采用Ampure磁珠進(jìn)行純化，并進(jìn)行Qubit定量；③測(cè)序：hiseq 2500平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)化上機(jī)測(cè)序；④測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估：測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina測(cè)序操控軟件（sequence control software，SCS）評(píng)估合格；⑤數(shù)據(jù)分析：去除接頭及低質(zhì)量數(shù)據(jù)；獲得clean data、基本數(shù)據(jù)；基因組分析工具包（the genome analysis toolkit，GATK）分析(variation calling)；SNV和Indel突變位點(diǎn)匯總；比對(duì)正常人群及已知致病人群數(shù)據(jù)：關(guān)聯(lián)人基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（human gene mutation database，HGMD）/千人基因組/人類基因組變異整合數(shù)據(jù)庫(kù)（genome aggregation database，gnomAD ）/本地人群頻率數(shù)據(jù)庫(kù)；已知疾病的基因突變點(diǎn)匯總（千人基因組頻率＜5%且本地人群頻率＜2%）；使用SIFT軟件利用基于同源比對(duì)、蛋白結(jié)構(gòu)保守性等的算法，預(yù)測(cè)篩選出變異對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，對(duì)剪切位點(diǎn)附近的突變，做剪接危害性預(yù)測(cè)；參照ACMG指南，篩選與臨床表型相關(guān)Pathogenic/Likely Pathogenic/Uncertain Significance的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)/Indel/exon基因拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）。(3)一代測(cè)序(Sanger法)驗(yàn)證：將二代測(cè)序得到的高度可疑變異位點(diǎn)擴(kuò)展至家系其他成員及100名正常對(duì)照進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)突變位點(diǎn)周圍序列設(shè)計(jì)引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI 3730XL測(cè)序儀測(cè)序，基因序列分析采用DNASTAR軟件進(jìn)行序列分析和比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 家系表型特征

該家系共2代3人，僅先證者發(fā)病，系譜分析符合常染色體隱性遺傳特征（見(jiàn)圖1）。I-1、I-2否認(rèn)近親婚配，均無(wú)Usher綜合征臨床表現(xiàn)。先證者出生3個(gè)月診斷為極重度感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失。

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)先證者II-1行全外顯子及剪切位點(diǎn)測(cè)序分析，結(jié)果顯示MYO7A基因存在兩個(gè)可疑突變c.3412C＞T(p.Q1138*)、c.4152G＞C (p.K1384N)，經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證顯示這兩個(gè)突變分別來(lái)自先證者的父母（表1，圖2）。

表1 家系的基因型結(jié)果

圖2 家系Sanger測(cè)序結(jié)果

3 討論

Usher綜合征具有高度遺傳異質(zhì)性，已明確I型致病基因共有6個(gè)，其中MYO7A基因突變?cè)贗型中最常見(jiàn)。MYO7A基因突變與常染色體顯性耳聾11型（AD）、常染色體隱性耳聾2型（AR）、Usher綜合征IB型（AR）相關(guān)[9]。該基因由49個(gè)外顯子組成，編碼2215個(gè)氨基酸的myosinⅦA肌球蛋白，主要在內(nèi)耳、視網(wǎng)膜、腎臟表達(dá)[10～11]。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致Usher綜合征I型的MYO7A突變位點(diǎn)505個(gè)，突變方式多樣，包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、移碼突變、插入突變及剪切位點(diǎn)突變[12]。MYO7A基因無(wú)熱點(diǎn)突變，因此發(fā)現(xiàn)該基因新的致病位點(diǎn)對(duì)于診斷Usher綜合征I型至關(guān)重要。

筆者通過(guò)靶向捕獲二代測(cè)序技術(shù)對(duì)疑似Usher綜合征I型的一個(gè)中國(guó)小家系先證者進(jìn)行了全基因外顯子測(cè)序和數(shù)據(jù)分析比對(duì)后鎖定MYO7A基因的兩個(gè)突變分別為c.3412C＞T(p.Q1138*)、c.4152G＞C(p.K1384N)。經(jīng)過(guò)一代測(cè)序驗(yàn)證兩個(gè)突變分別來(lái)自于先證者父母，而I-1和I-2無(wú)相似臨床表現(xiàn)，符合常染色體隱性遺傳模式。其中c.3412C＞T突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯提前中止p.Q1138*。HGMDpro數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)報(bào)道。根據(jù)ACMG指南，此變異類型評(píng)級(jí)為Pathogenic(致病性突變)，該突變位于第21號(hào)外顯子，為無(wú)義突變，導(dǎo)致蛋白翻譯終止，對(duì)蛋白功能的影響較大，且有較低的人群攜帶率[13]。另一個(gè)突變點(diǎn)c.4152G＞C，位于第31號(hào)外顯子，屬于錯(cuò)義突變，導(dǎo)致氨基酸改變p.K1384N。HGMDpro數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)報(bào)道。根據(jù)ACMG指南，其突變類型評(píng)級(jí)為L(zhǎng)ikely Pathogenic（可能致病性突變），筆者又采用多種預(yù)測(cè)軟件對(duì)該位點(diǎn)致病性進(jìn)一步預(yù)測(cè)，SIFT（http：//sift.jcvi.org）預(yù)測(cè)該突變點(diǎn)為D：Deleterious(有害突變)，PolyPhen-2(http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2）預(yù)測(cè)結(jié)果為P：Possibly damaging（可能有害突變），MutationTaster（http：//www.mutationtaster.org）預(yù)測(cè)結(jié)果為D：Disease_causing（致病性突變），進(jìn)一步用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法對(duì)100個(gè)正常人進(jìn)行分析，均未檢測(cè)到這兩個(gè)突變，再結(jié)合先證者的表型及基因型共分離分析，c.3412C＞T(p.Q1138*)、c.4152G＞C(p.K1384N)為該家系的致病突變。

近年來(lái)，隨著高效安全的轉(zhuǎn)染載體的不斷發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物模型中，針對(duì)Usher綜合征的基因治療成為可能。Pan[14]等將野生型的USH1C基因轉(zhuǎn)染到帶有Ush1c c.216G＞A突變的USH1C小鼠模型的內(nèi)耳中，驚喜的發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)染小鼠的聽(tīng)覺(jué)和平衡行為的恢復(fù)幾乎和野生型小鼠接近。Kevin Isgrig[15]等將野生型whirlin cDNA轉(zhuǎn)染到帶有whirler基因突變的Usher綜合征小鼠中，發(fā)現(xiàn)在4個(gè)月后小鼠的聽(tīng)力和平衡能力都有明顯的提高。動(dòng)物模型基因治療的成功也為人類Usher綜合征的治療帶來(lái)了希望，但基因治療依賴準(zhǔn)確的臨床診斷和分子學(xué)診斷。

綜上所述，筆者在一個(gè)臨床診斷為Usher綜合征IB型的中國(guó)家系中發(fā)現(xiàn)MYO7A的兩個(gè)新突變，c.3412C＞T(p.Q1138*)、c.4152G＞C (p.K1384N)，根據(jù)ACMG指南和軟件分析預(yù)測(cè)顯示這兩個(gè)突變?yōu)樵摷蚁档闹虏⊥蛔?，本研究拓展了Usher綜合征的突變譜，并對(duì)基因治療提供了靶點(diǎn)，但對(duì)于它的致病機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。