唐海歐，聶璽，張潔，張惠娟，謝安心，譚敦勇

吉首大學醫(yī)學院，湖南 吉首 4160000

人催乳素（human prolactin，hPRL）是腺垂體分泌的一種蛋白質(zhì)激素，由199個氨基酸殘基組成，其能夠促進乳腺的發(fā)育，引起并維持泌乳。催乳素與腫瘤細胞增殖的密切關(guān)系早已被認識。hPRL最主要的靶組織催乳素受體（prolactin receptor，PRLR）依據(jù)其存在形式分為兩類，一類是位于細胞膜表面的膜結(jié)合型人催乳素受體（human prolactin receptor，hPRLR），另一類是可溶型的人催乳素結(jié) 合 蛋 白（human prolactin binding protein，hPLRbp），可分泌到血液和乳汁中[1-2]。膜結(jié)合型hPRLR可以分為4種，而每種膜結(jié)合型hPRLR均含有膜外區(qū)（extracellular domain，ECD）、跨膜區(qū)（transmembrane domain，TD）和膜內(nèi)區(qū)（intracellular domain，ID）3個區(qū)域。4種膜結(jié)合型hPRLR的區(qū)別主要體現(xiàn)在ECD，而其TD和ID無明顯區(qū)別。其中，ECD由210個氨基酸構(gòu)成，可依據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同被分為S1和S2兩個亞結(jié)構(gòu)域，每個亞結(jié)構(gòu)域具有相對獨立的功能。Tan等[3]發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞和前列腺癌細胞中存在天然丟失S2的PRLR及相應(yīng)的mRNA和蛋白，并將其命名為ΔS2 PRLR（簡稱ΔS2），將全長PRLR命名為LF-PRLR，并已確定LF、SF1a及SF1b均存在相應(yīng)的ΔS2變體（ΔS2 LF-PRLR、ΔS2 SF1a-PRLR、ΔS2 SF1b-PRLR），其中，ΔS2 SF-1a簡稱為G8。有研究通過對PRLR進行定量分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的PRLR的表達水平高于正常組織[4]，這種PRLR的高表達引起了眾多學者的關(guān)注。PRLR作為乳腺癌發(fā)生的可能影響因素進入了流行病學調(diào)查及臨床研究中，結(jié)果卻不令人滿意。本研究探討了ΔS2 SF1a-PRLR對人類乳腺癌細胞轉(zhuǎn)錄組的影響，并從基因表達的差異性、差異基因GO富集、差異基因KEGG通路等多個方面分析其表達的差異，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

人胚腎HEK-293T細胞株、慢病毒過表達載體質(zhì)粒pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro、JM109感受態(tài)細胞均購自深圳市百恩維生物科技有限公司，人乳腺癌MCF-7細胞株由中南大學湘雅醫(yī)學院細胞庫惠贈，抗體[氨芐青霉素（ampicillin，AMP）、限制性內(nèi)切酶]均購自美國New England Biolab公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）消化液均購自美國invitrogen公司，TruSeq?Small RNA Sample Prep kit v2 Set B、Agilent 2200 TapeStation、Illumina Hiseq 2500測序儀均購自Illumina公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng) MCF-7的復(fù)蘇及鋪板：于-80℃的冰箱中取出凍存的乳腺癌細胞MCF-7，37℃水浴解凍細胞后轉(zhuǎn)入15 ml離心管，加入4 ml血清培養(yǎng)基，混勻細胞懸液，1000 r/min下離心5 min，離心半徑為15 cm，棄上清，加入2 ml的10%完全培養(yǎng)基重懸細胞，以1∶2的比例鋪板，于5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。細胞換液：棄培養(yǎng)皿中的全部培養(yǎng)基，加入10 ml新鮮的血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3天。細胞傳代：棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗2次，徹底棄除培養(yǎng)基中的血清。加入1 ml 0.25%胰蛋白酶，37°C消化2 min；顯微鏡下觀察，若貼壁細胞脫壁，加入1 ml 10%完全培養(yǎng)基終止消化，將細胞吹打混勻。收集細胞懸液，1000 r/min下離心5 min，離心半徑15 cm，棄上清，重懸細胞沉淀，以1∶3的比例鋪板，于5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。

1.2.2 攜帶ΔS2 SF1a-PRLR與SF1a-PRLR慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 為提高基因的轉(zhuǎn)染效率，采用慢病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染外源DNA至MCF-7細胞。其制作方法依據(jù)美國Stratagene公司建議的制作程序，基本步驟如下：①聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增ΔS2 SF1a-PRLR cDNA與SF1a-PRLR cDNA目的基因。②空白質(zhì)粒pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro與SF1a-PRLR和ΔS2 SF1a-PRLR的PCR產(chǎn)物通過EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，產(chǎn)物回收并連接。③脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，加入第1代病毒P1感染HEK-293T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集培養(yǎng)上清即為P2代；通過上述方法將病毒擴增至P3代；收集和純化P3代病毒。④穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞篩選和PCR鑒定，將經(jīng)慢病毒包裝的pLVX-con、pLVX-ΔS2 SF1a和pLVX-SF1a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MCF-7細胞，經(jīng)抗生素篩選48 h，收集穩(wěn)定表達SF1a、ΔS2 SF1a和con的基因組DNA，通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符。

1.2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞總RNA分離純化 將穩(wěn)定表達pLVX-con、pLVX-ΔS2 SF1a和pLVX-SF1a的MCF-7細胞于6孔板中培養(yǎng)，分別在每個孔加入1 ml Trizol溶液，室溫靜置消化5 min，使用1 ml的可調(diào)式移液器反復(fù)吹打細胞1～2 min，使細胞充分裂解，收集每個孔的裂解液至1.5 ml離心管中，分別于每個離心管中加入200 μl氯仿，然后劇烈振蕩30 s，使氯仿與裂解液充分混勻，室溫靜置5 min；然后在4℃的條件下離心15 min，12 500 r/min，輕輕采用移液器取上層液體至新的1.5 ml離心管中；于每個離心管中加入0.5 ml異丙醇，室溫靜置10 min；在4℃的條件下離心10 min，12 500 r/min，離心半徑5 cm；棄上清，可見在管底形成的RNA白色團塊。于每個離心管中加入1 ml 75%乙醇洗滌；4℃，7800 r/min，離心半徑5 cm，離心5 min；棄上清，打開離心管蓋，置于通風櫥中干燥沉淀；RNase-free雙蒸水溶解RNA，然后使用NanoDrop ND-2000檢測RNA濃度，放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將MCF-7細胞分組：空白對照組（con組）（空載體）、過表達SF1a-PRLR基因組（過表達SF1a-PRLR基因）、過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因組（過表達ΔS2SF1a-PRLR基因）。

1.2.4 cDNA文庫構(gòu)建 取1 μg質(zhì)檢合格的RNA樣品，嚴格按照TruSeq?Small RNA Sample Prep kit v2 Set B說明書構(gòu)建cDNA文庫，然后給每個RNA樣品加入3'端接頭和5'端接頭及隨機引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，以cDNA為模板進行PCR擴增；使用Agilent 2200 TapeStation試劑盒檢測文庫質(zhì)量，文庫質(zhì)檢合格后，按照Illumina Hiseq 2500測序平臺的操作說明制備上機樣本，然后按照single-end（1×50）標準測序程序進行測序；測序結(jié)束后，整理數(shù)據(jù)，并進行生物信息學統(tǒng)計和分析。

1.3 原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

通過Illumina測序技術(shù)共得到3個MCF-7樣本的原始測序結(jié)果（raw reads），本次測序采用的是第2代測序技術(shù)，單次測序可得到海量的數(shù)據(jù)，因數(shù)據(jù)量太大無法對每個read的質(zhì)量情況進行展示，故運用統(tǒng)計學的方法和技術(shù)，通過對測序數(shù)據(jù)進行堿基分布和質(zhì)量波動的分析統(tǒng)計，可從宏觀層面分析測序樣本的測序質(zhì)量和文庫構(gòu)建質(zhì)量。根據(jù)統(tǒng)計分析的結(jié)果確定能否進行后續(xù)分析。對測序質(zhì)量和文庫構(gòu)建質(zhì)量的分析包括A/T/G/C堿基含量分布統(tǒng)計、堿基質(zhì)量分布統(tǒng)計、堿基錯誤率分布統(tǒng)計。

1.4 樣本間表達量評估

對樣本進行樣本間相關(guān)性分析（一方面可以檢驗生物學重復(fù)之間的變異是否符合實驗設(shè)計的預(yù)期；另一方面，給3組樣本間的差異基因分析提供了基本的參考。相關(guān)系數(shù)越接近1，表明樣品間的相似度越高，計算所有樣品中兩兩樣品間的相關(guān)性）、樣本聚類分析（聚類是把相似的樣本通過靜態(tài)分類的方法分成不同的組別或者更多的子集，這樣使在同一個子集中的成員樣本具有一些相似的屬性，從而形成一個分組；組內(nèi)的樣本距離往往比組間的樣本更近）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、基因表達的差異性分析、差異基因基因本體論（gene oncology，GO）富集分析、差異基因KEGG通路分析、可變剪切分析、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分析。

2 結(jié)果

針對每個樣本的原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，包括對A/T/G/C堿基含量、堿基質(zhì)量和堿基錯誤率的分布統(tǒng)計；經(jīng)過測序數(shù)量質(zhì)量剪切及統(tǒng)計，與人類參考基因組對比，轉(zhuǎn)錄組整體質(zhì)量評估等，3組樣本所得數(shù)據(jù)具體分析結(jié)果如下。

2.1 樣本間表達量評估

2.1.1 樣本間相關(guān)性分析 G8-3、Con-1、1a-3（將SF1a簡稱為1a）與G8-1的相似度均偏低；其中，G8與G8-1的相似度僅約為0.7700。G8-3與1a-1的相似度最高，達到0.9358。（圖1）。

圖1 樣本間相關(guān)系數(shù)heatmap圖

2.1.2 PCA 通過主成分分析（principal component analysis，PCA）找出離群樣本，判別相似性高的樣品簇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G8-1、Con-2為離群樣本，G8-3、G8-2、1a-3、1a-2、1a-1為相似性高的樣品，Con-1、Con-3相似性低，無特殊意義。（圖2）

圖2 樣本主成分分析圖

2.2 基因表達的差異性分析

高通量測序結(jié)果顯示，SF1a-PRLR、ΔS2 SF1a-PRLR和con組的轉(zhuǎn)錄組表達存在差異。在con組和過表達SF1a-PRLR基因組中，4862個基因存在差異表達，其中2175個基因的表達水平降低，2687個基因的表達水平升高。在con組和過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因組中，4905個基因差異表達，其中2140個基因的表達水平降低，2765個基因的表達水平升高。而在過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因組和過表達SF1a-PRLR基因組中，僅有11個基因存在差異表達。

2.3 差異基因GO富集分析

通過對過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因、SF1a-PRLR基因、空載體的MCF-7細胞進行測序分析，通過GO數(shù)據(jù)庫將差異表達的基因在參與的生物學過程、分子功能和細胞組分3個方面進行歸類。

將過表達SF1a-PRLR基因組與con組的差異表達的基因進行GO注釋的統(tǒng)計，以con組作為對照，差異基因參與的生物學過程主要包括黏附、生長、對外來刺激的反應(yīng)、物質(zhì)代謝、免疫反應(yīng)等。差異基因的分子功能主要涉及結(jié)合、翻譯調(diào)節(jié)、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、抗氧化、形態(tài)發(fā)生等。差異基因主要富集到腎小管形態(tài)發(fā)生、多細胞生物大分子代謝過程、內(nèi)耳形態(tài)發(fā)生、上皮細胞管型的分支形態(tài)發(fā)生、上皮細胞遷移調(diào)節(jié)、細胞基質(zhì)黏附等。

將過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因組與con組差異表達的基因進行GO注釋的統(tǒng)計，以con組作為對照，差異基因參與的生物學過程主要包括代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物過程的正調(diào)節(jié)和負調(diào)節(jié)、激素分泌、生長、運動、對外來刺激的反應(yīng)、細胞殺傷、免疫反應(yīng)等。差異基因的分子功能主要涉及結(jié)合、翻譯監(jiān)控、受體調(diào)節(jié)、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、抗氧化、形態(tài)發(fā)生等。差異基因主要富集到形態(tài)發(fā)生、內(nèi)耳形態(tài)發(fā)生、陽性調(diào)節(jié)上皮細胞遷移、上皮細胞管型分支形態(tài)發(fā)生、細胞外基質(zhì)拆卸、細胞基質(zhì)黏附、調(diào)節(jié)軟骨細胞分化、細胞對酸性化學物質(zhì)的反應(yīng)、細胞底物黏附、神經(jīng)鞘脂代謝過程、對有機磷的反應(yīng)、胚胎胎盤發(fā)育、調(diào)節(jié)ERK1和ERK2級聯(lián)、腺體發(fā)育。

將過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因組與過表達SF1a-PRLR基因組差異表達的基因進行GO注釋的統(tǒng)計，以過表達SF1a-PRLR基因組作為對照，通過GO數(shù)據(jù)庫進行功能富集分析，結(jié)果顯示，因差異基因較少，兩組的基因表達不能形成顯著性差異。

2.4 差異基因KEGG通路分析

以con組的基因表達作為對照，將過表達SF1a-PRLR基因組與con組的差異表達基因進行京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）中的通路注釋。結(jié)果顯示，兩組的差異基因主要被注釋到代謝通路，共262個差異基因；有111個差異基因被注釋到與腫瘤有關(guān)的信號通路；在與腫瘤有關(guān)的信號通路中，主要包括細胞周期的調(diào)控（有P21、E2/F、CDK4/6、CKS1等基因參與），Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）、Wnt、絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又 稱AKT）信號通路導(dǎo)致的細胞增殖、血管生成等；有36個差異基因被注釋到調(diào)節(jié)干細胞多能性信號通路。其中，MAPK、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、PI3K/AKT、環(huán)腺苷一磷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、Hedgehog、Hippo信號通路與ECM受體相互作用，調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用的信號通路等，其與腫瘤細胞增殖、遷移和耐藥等密切相關(guān)。

以con組的基因表達作為對照，將過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因組與con組的差異表達基因進行KEGG通路注釋，結(jié)果顯示，兩組的差異表達基因（261個）主要被注釋到代謝通路；有112個差異表達基因被注釋到與腫瘤有關(guān)的信號通路。在與腫瘤有關(guān)的信號通路中主要包括細胞周期調(diào)控（有P21、E2/F、CDK4/6、CKS1等基因參與）、血管生成有關(guān)的信號通路，與增殖有關(guān)的JAT-STAT、Wnt、MAPK、PI3K/AKT等細胞凋亡通路。其中，MAPK、TNF、TGF-β、PI3K/AKT、ErbB、Hedgehog、Hippo信號通路，ECM受體相互作用、細胞因子-細胞因子受體相互作用等信號通路與腫瘤細胞增殖、遷移和耐藥等密切相關(guān)。

將過表達SF1a-PRLR基因組和過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因組的差異基因進行通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因后，差異基因顯著富集于TGF-β、磷脂酰肌醇、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、肌醇磷酸酯代謝、氧化磷酸化、補體和凝血級聯(lián)等信號通路中。

2.5 可變剪切分析

在3組樣本中主要發(fā)現(xiàn)了6種不同的剪切模式。其中，在con組的MCF-7細胞中，發(fā)生外顯子跳躍的基因數(shù)目是2976個，發(fā)生內(nèi)含子保留的基因數(shù)目是592個，發(fā)生5'端和3'端可變剪接的基因數(shù)目分別是3536個、3709個，發(fā)生5'UTR端和3'UTR端可變剪接的基因數(shù)目分別是1581個、2080個。在過表達SF1a-PRLR基因組的MCF-7細胞中，發(fā)生外顯子跳躍的基因數(shù)目為3537個，發(fā)生內(nèi)含子保留的基因數(shù)目是713個，發(fā)生5'端和3'端可變剪接的基因數(shù)目分別是4489個和4535個，發(fā)生5'UTR端和3'UTR端可變剪接的基因數(shù)目分別是2235個、2640個。在過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因組的MCF-7細胞中，發(fā)生外顯子跳躍基因數(shù)目為3306個，發(fā)生內(nèi)含子保留的基因數(shù)目是685個，發(fā)生5'端可變剪接的基因數(shù)目是4215個，發(fā)生3'端可變剪接的基因數(shù)目是4211個，發(fā)生5'UTR端可變剪接的基因數(shù)目是2125個，發(fā)生3'UTR端可變剪接的基因數(shù)目是2482個。（圖3）

圖3 不同類型可變剪切模式的統(tǒng)計圖

2.6 SNP分析

通過軟件分析3組樣本的SNP位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達SF1a-PRLR基因組的MCF-7細胞中有42 885個SNP位點，過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因組的MCF-7細胞中有37 305個SNP位點，con組的MCF-7細胞中有31 583個SNP位點。

3 討論

3.1 慢病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率

在前期實驗中，運用目前最常用的轉(zhuǎn)染化學試劑（如Lipofectamine 2000等）將外源DNA（或cDNA）轉(zhuǎn)染至乳腺癌細胞（MCF-7細胞等），但轉(zhuǎn)染效率低（20%以下）；若在此種情況下繼續(xù)進行實驗，實驗結(jié)果不可靠。為了解決這一問題，本研究構(gòu)建了攜帶ΔS2 SF1a-PRLR與SF1a-PRLR的慢病毒載體。利用慢病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染外源DNA至MCF-7細胞，理論上，其轉(zhuǎn)染效率能夠達到100%。細胞轉(zhuǎn)染后，熒光顯微鏡下計數(shù)綠色熒光細胞（陽性細胞）數(shù)目和總細胞數(shù)目（每個樣品多次隨機選5～7個400倍視野，計數(shù)700個以上細胞），計算平均轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染率=（陽性細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目）×100%，經(jīng)計算其轉(zhuǎn)染率可達90%。

3.2 SF1a-PRLR基因和ΔS2 SF1a-PRLR基因

本實驗主要研究的是過表達SF1a-PRLR基因和ΔS2 SF1a-PRLR基因在MCF-7乳腺癌細胞中的表達差異，結(jié)果表明，兩者有11個基因的表達存在明顯差異，但由于未進行細胞增殖實驗，因此，還無法明確過表達SF1a-PRLR基因和ΔS2 SF1a-PRLR基因?qū)θ橄侔┘毎鲋城闆r的具體影響。在con組和過表達SF1a-PRLR基因組中，有4862個基因存在差異表達，其中，有2175個基因的表達水平降低，有2687個基因的表達水平升高，提示基因的差異表達與過表達SF1a-PRLR基因有關(guān)，通過影響這些基因的表達調(diào)控乳腺癌細胞的增殖。在con組和過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因組中，有4905個基因差異表達，其中，有2140個基因的表達水平降低，有2765個基因的表達水平升高，提示基因的差異表達與不同的處理方式有關(guān)，即過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因能夠影響這些基因的表達，提示這些基因參與ΔS2 SF1a-PRLR基因?qū)θ橄侔┥L的調(diào)控。而在過表達ΔS2 SF1a-PRLR基因組和過表達SF1a-PRLR基因組中，有11個基因存在差異表達，提示ΔS2 SF1a-PRLR和SF1a-PRLR基因?qū)毎挠绊戄^小，或者通過蛋白質(zhì)活性影響細胞功能。

3.3 Ras-Raf-MAPK信號通路與乳腺癌的關(guān)系

Ras-Raf-MAPK信號通路的異常激活在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[5]。GTP結(jié)合蛋白Ras和Raf中致癌突變是多種腫瘤中的常見事件，如肺、結(jié)腸直腸、胰腺和黑素瘤等[6]。該通路的Raf和蛋白激酶MEK特異性小分子抑制劑，在治療具有鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）V600E突變的晚期黑素瘤方面取得了巨大的成功[7]。利用Raf和MEK抑制劑治療黑素瘤的成功表明某些腫瘤依賴于Ras/MAPK通路的激活。與其他上皮癌相比，經(jīng)典Ras/MAPK通路中的激活突變現(xiàn)象在乳腺癌中是非常罕見的事件。盡管如此，Ras/MAPK通路在乳腺癌中的重要作用已被證實。值得注意的是，Ras/MAPK活性的增強可以通過其他機制或因素的異常刺激，包括酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinase，RTK）的表達，如 EGFR 和HER2的過度表達。研究證實，在相對于原發(fā)性乳腺腫瘤的轉(zhuǎn)移灶中觀察到ERK1和ERK2的活性升高，這是異常Ras功能的主要激活方式，并且在三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）中更為常見[8]。Ras/MAPK信號通路的激活是三陰性乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵原因[9]。免疫組織化學法進一步證實了TNBC與Ras/MAPK活性的關(guān)系，且活化的Ras的乳腺組織特異性表達足以誘導(dǎo)發(fā)生小鼠乳腺癌。MAPK信號激活的替代機制在乳腺上皮細胞的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要的作用。

Ras/MAPK信號通路通過嚴格控制負調(diào)節(jié)機制調(diào)節(jié)有絲分裂信號的強度和持續(xù)時間。類似于第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因（gene of phosphate and tension homologue deleted on chromosome ten，PTEN）突變或缺失導(dǎo)致 PI3K/AKT通路的激活，負調(diào)節(jié)能力的喪失同樣可以導(dǎo)致腫瘤中不受控制的MAPK通路的激活，如神經(jīng)纖維蛋白（neurofibromatosis typye 1，NF1）通過加速GTP水解成GDP來催化Ras的失活[10]。在乳腺癌中已經(jīng)檢測到NF1基因的體細胞改變，而在黑素瘤中，NF1的缺失已經(jīng)顯示其細胞學行為依賴于Ras/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對MEK抑制的敏感程度。截短和缺失的NF1導(dǎo)致Ras和下游MAPK通路的組成型活性參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[11]。

此外，微小RNA（microRNA，miRNA）也是腫瘤細胞中調(diào)控細胞增殖、分化與凋亡的靶點[12]。許多靶向Ras/MAPK通路成分的miRNA已經(jīng)經(jīng)過鑒定，其中，包括功能明確的let-7 miRNA[13]。其中，幾個miRNA的靶蛋白調(diào)控K-RAS，因此，miRNA的功能喪失可能作為TNBC中異常Ras/MAPK通路活性的調(diào)控因素。有研究顯示，介導(dǎo)let-7miRNA結(jié)合與調(diào)控的KRAS基因座中的SNP與患TNBC的風險的增加及乳腺原發(fā)腫瘤有關(guān)[14]。

綜上所述，過表達SF1a-PRLR基因和ΔS2 SF1a-PRLR基因能夠影響MCF-7乳腺癌細胞的基因表達，且其通過 MAPK、TGF-β、PI3K/AKT、Hedgehog等信號通路影響乳腺癌細胞的增殖。