余江濤，孫德利

鄭州人民醫(yī)院普外科，鄭州 4500030

甲狀腺癌是一種發(fā)病率在頭頸部腫瘤和內(nèi)分泌腺腫瘤中居首位的惡性腫瘤。2015年中國(guó)腫瘤數(shù)據(jù)顯示，甲狀腺癌已成為中國(guó)中青年女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。近年來(lái)，甲狀腺癌的發(fā)病率和病死率有明顯的上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人們的生活和身體健康。甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，受到癌基因和抑癌基因等多種調(diào)控機(jī)制的共同作用。尋找有效調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用靶點(diǎn)一直是研究的熱點(diǎn)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與細(xì)胞惡性增殖有關(guān)，也與細(xì)胞的凋亡異常密切相關(guān)。存活蛋白（survivin）是一種在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用的凋亡抑制蛋白，大量研究表明，survivin在肺癌、乳腺癌和大腸腺癌多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，與多種腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)[2-4]。研究提示，干擾survivin表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5-6]，但目前關(guān)于survivin對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡影響的研究較少。本研究通過(guò)觀察survivin在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，采用RNA干擾技術(shù)調(diào)控其表達(dá)后，探討survivin對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡的影響，以期為甲狀腺癌的分子機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取鄭州人民醫(yī)院2014年9月至2017年3月收治的98例甲狀腺癌切除患者的甲狀腺癌組織標(biāo)本及其相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，所有組織標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)，收集的標(biāo)本均儲(chǔ)存于液氮罐中。98例甲狀腺癌患者中，男性32例，女性66例，年齡25～68歲，平均（42.62±12.25）歲。人甲狀腺癌細(xì)胞株SW579和正常甲狀腺細(xì)胞株Nthy-ori3-1均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典藏細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑和儀器

根據(jù)Genebank中survivin特異性DNA序列采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)survivinsiRNA，正義序列：5'-GCAUCUCUACAUUCAAGAAdTdT-3'；反義序列：5'-UUCUUGAAUGUAGAGAUGCdTdT-3'。以與所有基因均無(wú)同源性序列的non-target siRNA作為陰性對(duì)照序列。survivinsiRNA和non-target siRNA均由上海吉瑪公司合成。RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素雙抗和Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin VFITC/PI）凋亡試劑盒、電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯色液、放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京凱基公司，兔抗人survivin多克隆抗體、鼠抗人β肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體、兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體、兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase 3）多克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的抗鼠或抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulinG，IgG）-HRP二抗均購(gòu)自美國(guó)Santancruz公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.3 免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)甲狀腺組織中survivin的表達(dá)

取收集的甲狀腺癌組織和癌旁組織，置于加有液氮的研缽中迅速研磨至粉末，在冰上充分裂解后，離心，獲得上清液。采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)總蛋白的濃度。取變性蛋白50 μg，上樣至濃度為10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離。待電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜上，經(jīng)濃度為5%的脫脂奶粉4℃下封閉2 h后，加入均以1∶500稀釋的survivin多克隆抗體和β-actin單克隆抗體，于4℃孵育過(guò)夜，次日洗膜后加入1∶1000稀釋的IgG-HRP二抗，室溫孵育2 h，以ECL顯色液顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以β-actin作為內(nèi)參，分析survivin的相對(duì)表達(dá)水平。設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所有樣本均進(jìn)行Western blot，最后取蛋白相對(duì)表達(dá)量的平均值。

1.4 培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染SW579細(xì)胞

將甲狀腺癌SW579細(xì)胞和正常甲狀腺Nthyori3-1細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基上，置于設(shè)定條件為37℃、5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW579細(xì)胞和Nthy-ori3-1細(xì)胞，采用1.3中的方法檢測(cè)兩種細(xì)胞中survivin的相對(duì)表達(dá)情況，其中每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW579細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，以每孔2 ml接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分為干擾組、陰性組和對(duì)照組。根據(jù)Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒的轉(zhuǎn)染條件和方法將干擾組和陰性組中的細(xì)胞分別以survivinsiRNA和non-target siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對(duì)照組中的細(xì)胞不做任何處理。所有細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，更換為新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。為了檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效果，收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中survivin的相對(duì)表達(dá)水平，步驟同1.3。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取轉(zhuǎn)染后的上述3組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103/ml，經(jīng)離心、固定和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后，使用 500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再分別加入Annexin V-FITC 5 μl、PI10 μl，避光反應(yīng)15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。每組均設(shè)3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況

為了進(jìn)一步探討survivin在甲狀腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，取轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，以BCA法檢測(cè)總蛋白的濃度，再按照1.3中的步驟進(jìn)行操作，分別檢測(cè)各組細(xì)胞中cleaved caspase 3和Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)-軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 survivin在甲狀腺癌組織及癌旁組織中表達(dá)情況的比較

Western blot檢測(cè)survivin在甲狀腺癌組織及癌旁組織中的蛋白表達(dá)情況，甲狀腺癌組織中survivin蛋白相對(duì)表達(dá)量為（2.55±0.72），明顯高于癌旁組織中的（0.62±0.25），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=25.068，P＜0.01）。（圖1）

圖1 Western blot檢測(cè)survivin在甲狀腺癌組織（n=98）及癌旁組織（n=98）中的表達(dá)情況

2.2 survivin在甲狀腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染效果

Western blot檢測(cè)survivin在甲狀腺癌SW579細(xì)胞和正常甲狀腺Nthy-ori3-1細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.64±0.07）和（0.13±0.02），SW579細(xì)胞中survivin的相對(duì)表達(dá)量明顯高于Nthy-ori3-1細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.134，P＜0.01）（圖2）。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染干擾survivin在SW579細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)照組、陰性組和干擾組細(xì)胞中survivin相對(duì)表達(dá)量分別為（0.72±0.12）、（0.68±0.11）和（0.16±0.05），3組survivin相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.290，P=0.001）；對(duì)照組與陰性組細(xì)胞中survivin相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.426，P=0.692）；干擾組細(xì)胞中survivin相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.461，P=0.002）（圖3）。

圖2 Western blot檢測(cè)survivin在SW579和Nthy-ori3-1細(xì)胞中的表達(dá)情況

圖3 Western blot檢測(cè)survivin在對(duì)照組、陰性組、干擾組細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.3 沉默survivin表達(dá)對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡率的影響

沉默survivin表達(dá)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組、陰性組和干擾組細(xì)胞的凋亡率分別為（12.65±1.52）%、（11.86±1.75）%、（42.38±3.42）%，3 組凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=159.582，P＜0.01）；對(duì)照組與陰性組細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.590，P=0.587）；干擾組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.759，P＜0.01）。（圖4）

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組細(xì)胞的凋亡率

2.4 沉默survivin表達(dá)對(duì)cleaved caspase 3和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探討沉默survivin表達(dá)促進(jìn)SW579細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中cleaved caspase 3和Bcl-2的表達(dá)情況。干擾組細(xì)胞中cleaved caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；陰性組和對(duì)照組cleaved caspase 3和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖5、表1）

圖5 Western blot檢測(cè)cleaved caspase 3和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況

表1 對(duì)照組、陰性組、干擾組細(xì)胞中cle-aved caspase 3和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表1 對(duì)照組、陰性組、干擾組細(xì)胞中cle-aved caspase 3和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：*與干擾組比較，P＜0.01

組別對(duì)照組陰性組干擾組F值P值cleaved caspase 3 0.26±0.05*0.32±0.06*1.15±0.24 34.959 0.001 Bcl-2 0.86±0.15*0.78±0.22*0.18±0.06 16.687 0.004

3 討論

survivin是凋亡抑制蛋白家族中最簡(jiǎn)單但功能最強(qiáng)的凋亡抑制基因，位于人17q25染色體上，由3個(gè)內(nèi)顯子和4個(gè)外顯子構(gòu)成，可編碼142個(gè)氨基酸。survivin基因通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)水平促進(jìn)血管生成，調(diào)控線粒體通路或死亡受體通路抑制細(xì)胞凋亡，以及間接抑制紡錘體的水解參與細(xì)胞周期的調(diào)控等作用機(jī)制，在甲狀腺癌等多種疾病的形成和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[7-8]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，survivin作為腫瘤治療的一個(gè)優(yōu)先目標(biāo)或分子靶點(diǎn)在腫瘤的診斷和治療方面具有重要作用[9-10]。甲狀腺癌發(fā)生和發(fā)展的作用機(jī)制目前尚不明確，隨著近年來(lái)甲狀腺癌的發(fā)展趨勢(shì)，研究survivin在甲狀腺癌中的作用機(jī)制，為尋找新的有效診斷和治療甲狀腺癌的方法提供理論意義。有研究發(fā)現(xiàn)，采用小干擾RNA干擾survivin在鼻咽癌和宮頸癌中的表達(dá)后，可明顯促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[11-12]。為了探討survivin在甲狀腺癌中的作用機(jī)制，本研究首先觀察了甲狀腺癌組織和細(xì)胞中survivin的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，survivin在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中均呈高表達(dá)。提示，survivin在甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)其表達(dá)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)甲狀腺癌SW579細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，沉默survivin表達(dá)的細(xì)胞凋亡率明顯升高。提示，沉默survivin表達(dá)可抑制甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是一種維持機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育的生理性死亡過(guò)程，細(xì)胞凋亡的紊亂是多種疾病形成和發(fā)展的誘導(dǎo)因素。細(xì)胞凋亡是一個(gè)受多基因和蛋白共同調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。caspase家族是一類(lèi)在細(xì)胞凋亡和分化過(guò)程中起重要作用的功能性蛋白酶，caspase 3作為caspase家族中重要的細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白，處在caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，在促進(jìn)細(xì)胞的凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Bcl家族在細(xì)胞凋亡的主要內(nèi)在途徑——線粒體途徑中發(fā)揮著重要作用，Bcl-2作為Bcl家族蛋白中重要的抗凋亡蛋白，在抑制細(xì)胞凋亡延長(zhǎng)細(xì)胞壽命方面起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。caspase 3和Bcl-2在甲狀腺癌腫瘤組織中異常表達(dá)，與甲狀腺癌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[13-14]。大量學(xué)者認(rèn)為，survivin與caspase 3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與Bcl-2表達(dá)呈正相關(guān)。王傳艷等[15]和Gu等[16]在探討survivin和caspase 3在食管鱗癌和前列腺癌中的表達(dá)研究中指出，survivin的表達(dá)與caspase 3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。齊志勇等[17]及Zhou和Wang[18]在研究survivin和Bcl-2在喉癌和宮頸癌中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，survivin的陽(yáng)性表達(dá)率與Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)。丁亦含等[19]通過(guò)survivin抑制劑抑制survivin基因表達(dá)后，白血病K562細(xì)胞中caspase 3的表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平下降。為了探討沉默survivin表達(dá)促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，本研究采用Western blot檢測(cè)干擾survivin表達(dá)后，SW579細(xì)胞中cleaved caspase 3和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾survivin表達(dá)后，cleaved caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低。結(jié)果提示，沉默survivin表達(dá)可通過(guò)上調(diào)cleaved caspase 3和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)引起甲狀腺癌SW579細(xì)胞凋亡。

綜上所述，survivin在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)。沉默survivin表達(dá)，可通過(guò)上調(diào)cleaved caspase 3蛋白的表達(dá)和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。此結(jié)果為survivin在甲狀腺癌中的作用機(jī)制及以survivin為甲狀腺癌基因治療的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。