陶海云，屈中玉，吳艷林，蔡政

1南陽市中心醫(yī)院腫瘤科，河南 南陽 473000

2云南省中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，云南 昆明 6500210

乳腺癌是女性較常見的惡性腫瘤之一，其中三陰性乳腺癌占所有乳腺癌病理類型的10.0%～20.8%[1]。三陰性乳腺癌是指腫瘤組織免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果為雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progestogen receptor，PR）和原癌基因人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）均為陰性的乳腺癌[2]。三陰性乳腺癌具有特殊的生物學(xué)行為和臨床特征，預(yù)后較其他類型乳腺癌差[3]，因此，尋找新的治療策略，以提高三陰性乳腺癌患者的療效及改善預(yù)后至關(guān)重要。程序性死亡受體1（programmed cell death l，PDCD1，也稱PD-1）及程序性死亡受體配體 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）是近年來出現(xiàn)的一種新型免疫療法[4]，主要通過阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以達(dá)到治療目的[5]。相關(guān)研究表明，PD-1/PD-L1靶向治療對(duì)晚期惡性黑色素瘤具有良好的預(yù)后結(jié)果[6]，因此本研究對(duì)PD-1/PD-L1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)情況及其臨床意義進(jìn)行探討，以期為三陰性乳腺癌的臨床治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月至2017年12月南陽市中心醫(yī)院收治的39例三陰性乳腺癌患者的乳腺癌組織（1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm）存檔石蠟標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性乳腺癌；②術(shù)前均未接受放化療治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤。選取同期于南陽市中心醫(yī)院行手術(shù)切除的病理診斷為非三陰性乳腺癌的39例患者的乳腺癌組織（1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm）石蠟標(biāo)本為對(duì)照。兩組患者的年齡、絕經(jīng)情況、腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤侵犯神經(jīng)情況及脈管內(nèi)癌栓情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1），具有可比性。

表1 兩組患者的基本臨床特征

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)三陰性乳腺癌組織和非三陰性乳腺癌組織中PD-1和PD-L1水平。具體方法：石蠟組織切片，經(jīng)二甲苯、乙醇脫蠟和水化后，用檸檬酸鹽修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，再經(jīng)過氧化氫水溶液處理，分別加入兔抗人PD-L1（稀釋比例1∶100）及PD-1抗體（過氧化氫水溶液1∶100）孵育，用新鮮配制的3，3-二氨基聯(lián)苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）溶液顯色，再將切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，最后中性樹脂封固，于400倍鏡下觀察細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)的染色情況?？谷薖D-1單克隆抗體和兔抗人PD-L1單克隆抗體均購自Cell Signaling公司，DoubleStain免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購自Abcam公司，濃縮型DAB顯色試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

PD-1和PD-L1染色陽性為細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)清晰的棕黃色至棕褐色顆粒，細(xì)胞不著色或細(xì)胞著色率＜5%認(rèn)為是陰性表達(dá)，細(xì)胞著色率≥5%認(rèn)為是陽性表達(dá)，腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)內(nèi)任一項(xiàng)陽性均為陽性表達(dá)[7]。細(xì)胞著色率為400倍視野下著色細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)比值，共計(jì)數(shù)3個(gè)視野，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟-件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)情況的比較

三陰性乳腺癌組織中PD-1蛋白的陽性表達(dá)率為28.21%（11/39），高于非三陰性乳腺癌組織的10.26%（4/39），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.044，P=0.044）；三陰性乳腺癌組織中PD-L1蛋白的陽性表達(dá)率為41.03%（16/39），高于非三陰性乳腺癌組織的15.38%（6/39），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.331，P=0.012）。

2.2 乳腺癌組織中PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)情況與三陰性乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系

不同年齡、絕經(jīng)情況、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤侵犯神經(jīng)情況、脈管內(nèi)癌栓情況三陰性乳腺癌患者乳腺癌組織中PD-1、PD-L1蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征三陰性乳腺癌患者乳腺癌組織中PD-1、PD-L1蛋白的陽性表達(dá)情況

3 討論

乳腺癌是女性較為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著女性的身心健康[8]。三陰性乳腺癌是一類具有特殊生物學(xué)行為和臨床特征，且預(yù)后較其他類型差的難治性乳腺癌[9]。目前，臨床對(duì)三陰性乳腺癌患者一般僅行常規(guī)化療，這主要是因?yàn)楝F(xiàn)有的抗HER2治療、內(nèi)分泌治療等對(duì)三陰性乳腺癌患者的治療效果均較差[10]。但常規(guī)化療的不良反應(yīng)較大，部分耐受能力差的患者無法完成整個(gè)化療周期，且化療后又極易出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移[11]，故尋找新的有效的治療策略對(duì)三陰性乳腺癌患者的治療尤為重要。

PD-1屬于免疫共刺激分子家族成員之一，主要表達(dá)于多種免疫細(xì)胞，如成熟的T細(xì)胞、B細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及單核細(xì)胞等[12]。PD-L1是PD-1的重要配體之一，廣泛表達(dá)于多種淋巴組織及腫瘤組織[13]。相關(guān)研究表明，PD-1/PD-L1信號(hào)通路參與細(xì)胞凋亡及T/B細(xì)胞活化過程[14]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PD-1/PD-L1信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸密切相關(guān)[15]。PD-1與PD-L1結(jié)合可以抑制多種炎性因子的釋放，抑制淋巴細(xì)胞的增殖與活化，削弱機(jī)體的免疫監(jiān)視作用，從而促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[16]。因此，靶向PD-1/PD-L1的腫瘤免疫療法成為近年來出現(xiàn)的一種新型腫瘤治療方法，該方法主要是通過阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及破壞腫瘤免疫逃逸系統(tǒng)，從而達(dá)到腫瘤治療的目的[17]。相關(guān)研究表明，PD-1/PD-L1靶向治療對(duì)晚期惡性黑色素瘤具有良好的預(yù)后結(jié)果[18]。

本研究結(jié)果顯示，三陰性乳腺癌組織中PD-1和PD-L1的陽性表達(dá)率均高于非三陰性乳腺癌組織（P＜0.05），這提示三陰性乳腺癌組織中PD-1和PD-L1呈一致性陽性表達(dá)，推測(cè)三陰性乳腺癌患者可能從靶定PD-1/PD-L1的免疫治療中獲益。本研究進(jìn)一步分析了PD-1、PD-L1表達(dá)情況與三陰性乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示：PD-1、PDL1陽性表達(dá)與三陰性乳腺癌患者的年齡、絕經(jīng)情況、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤侵犯神經(jīng)情況及脈管內(nèi)癌栓情況無關(guān)（P＞0.05），這與Brockhoff等[19]的研究結(jié)果一致。上述結(jié)果提示，PD-1和PD-L1的表達(dá)水平可能與三陰性乳腺癌患者的病情進(jìn)展無關(guān)，但三陰性乳腺癌組織中PD-1和PD-L1的陽性表達(dá)率明顯高于非三陰性乳腺癌，這提示PD-1和PD-L1有可能參與了三陰性乳腺癌的發(fā)生，檢測(cè)PD-1和PD-L1的表達(dá)對(duì)早期診斷三陰性乳腺癌可能具有積極意義，同時(shí)，阻斷PD-1和PD-L1信號(hào)通路可能成為三陰性乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，在三陰性乳腺癌中PD-1、PD-L1具有較高的陽性表達(dá)率，阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路可能成為三陰性乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)，但本研究未發(fā)現(xiàn)PD-1、PD-L1陽性表達(dá)與乳腺癌患者的臨床特征有關(guān)，這可能因?yàn)楸狙芯考{入的樣本量較少。因此，今后仍需進(jìn)一步加大樣本量，以研究PD-1和PD-L1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)情況及其與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系，為三陰性乳腺癌的臨床診治提供更可靠的參考依據(jù)。