賴 銳，邱玉芳，劉惟優(yōu)

(贛南醫(yī)學院 1.2016級碩士研究生;2.第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江西 贛州 341000)

隱球菌是一種無菌絲的單細胞芽生的酵母型真菌，廣泛存在于空氣、土壤、樹木和鴿糞中[1-2]。致病菌主要包括新型隱球菌和格特隱球菌，其分子分型目前主要分5型：血清型A、D、 AD、B和血清型C，前三型多見于新型隱球菌，后兩型多見于格特隱球菌[3]。全球每年約有100萬人感染隱球菌，并且造成約63萬人死亡[4-7]。新型隱球菌多見于撒哈拉以南非洲，主要感染免疫功能低下，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)和器官移植者[8]，而格特隱球菌多見于熱帶和亞熱帶地區(qū)，但曾在溫哥華島爆發(fā)流行，常感染免疫功能正常的宿主[8]。有研究報道：在中國，最常見的真菌病原體是假絲酵母屬，其次是隱球菌屬(7.7%)。近年以來，我國隱球菌屬的感染逐漸增加，無論是大陸還是臺灣都以新生隱球菌菌株的血清型A、基因型VNI和交配型α占主導地位，且多見于免疫功能正常者，但HIV感染仍然是我國隱球菌病最常見的危險因素[2,9]。

近年來，廣譜抗生素、HIV感染、腫瘤放療和化療、器官移植、皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等的增加也使隱球菌感染的發(fā)病率增加[10-11]，且患病率和致死率也在全球范圍內(nèi)升高，有研究發(fā)現(xiàn)，無高危因素的隱球菌病比存在高危因素的隱球菌病的診斷需多2倍時間，導致死亡率升高究其原因是對隱球菌感染的的認識不夠，未能早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療[12-13]。本文主要根據(jù)近幾年隱球菌感染的診斷方法從血液學、病原學、影像學、免疫學和病理學以及分子生物學等方面進行闡述。

1 血液學檢查

一般血液學檢測無特異性，很難與病毒、細菌感染鑒別。血白細胞計數(shù)可正常或輕中度升高，多數(shù)在10 ×109·L-1～ 20×109·L-1之間, 中性粒細胞可輕度升高，病情進展中后期可出現(xiàn)血紅蛋白及紅細胞數(shù)減少。感染指標：C反應(yīng)蛋白(CPR)或降鈣素原(PCT)都可輕度升高，也可出現(xiàn)血沉加快。隱球菌患者血清1，3-β-D葡聚糖(G試驗)常為陰性，這是由于隱球菌細胞壁中1，3-β-D葡聚糖含量少且外層包裹很厚的莢膜多糖所導致的。而血半乳糖甘露聚糖試驗(GM試驗)陽性率也很低，只有在隱球菌抗原滴度很高時，才易檢出[14]。

2 病原學涂片和培養(yǎng)

檢測方法簡單，常用于疾病篩查，標本相對容易收集。標本主要包括痰、肺泡灌洗液、胸水、血液、腦脊液和尿液等。

2.1痰涂片和培養(yǎng)可見真菌孢子或隱球菌孢子包囊提示陽性，該檢查法標本易收集，費用便宜，有助于篩查，但兩者陽性率都較低，分別為25%和55%～80%，且缺乏特異性[15-16]。由于兩者的陽性率與收集標本途徑密切相關(guān)，所以條件允許下，可進行有創(chuàng)檢查(如經(jīng)纖維支氣管鏡保護性毛刷、肺泡灌洗或經(jīng)支氣管壁透壁肺活檢、彩超引導下胸腔穿刺采取胸腔積液等)。若培養(yǎng)和(或)鏡檢發(fā)現(xiàn)隱球菌可確診，但單次培養(yǎng)陽性并不能區(qū)分污染、定植和感染，所以對懷疑隱球菌肺感染者，應(yīng)反復多次多途徑培養(yǎng)，只有多次培養(yǎng)陽性才有參考價值。此外，若AIDS患者痰培養(yǎng)新生隱球菌陽性，應(yīng)提高警惕，其可能存在播散性感染。

2.2腦脊液(CSF) 墨汁染色涂片是診斷隱球菌性腦膜炎最簡單、快速的檢測方法，其靈敏度與是否感染HIV也密切相關(guān)，未感染和感染HIV的隱球菌腦膜炎靈敏度分別為30%～50%和80%[17]，對腦脊液進行離心后鏡檢可以增加靈敏度，但淋巴細胞、髓小球、脂肪小滴、組織細胞以及其他酵母形式易導致假陽性，且該檢測方法不能判斷臨床治療療效。有人提出，吖啶橙染色靈敏度為96%，可以替代墨汁染色[18]。樊新紅等研究顯示[19]，腦脊液阿立新蘭染色對隱球菌的檢出率可達95.8%，其可以使隱球菌莢膜內(nèi)的酸性黏多糖著色，而對其他炎癥細胞不著色，且其檢測方法也簡便。CSF培養(yǎng)陽性可見乳白色奶油菌落生長，長時間孵育后可能變成橙黃色或棕色菌落，這可確診中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染。HIV感染者培養(yǎng)陽性率高于非感染者，可達90%，而隱球菌腦炎或腦膜炎患者的血培養(yǎng)陽性率僅70%[20]。

3 影像學

為隱球菌感染的輔助診斷方法，影像表現(xiàn)變化多樣，且缺乏特異性，但其可作為篩查手段，也可作為病情轉(zhuǎn)歸的評估方法。此外，MRI可辨別隱球菌細胞壁結(jié)構(gòu)，可與腫瘤相鑒別。

3.1肺隱球菌病的肺部CT 表現(xiàn)可分為以下三種類型[21-23]：①結(jié)節(jié)或腫塊型：以單發(fā)或多發(fā)結(jié)節(jié)型多見，約占 40%～60%，常見于單側(cè)下肺外帶靠近胸膜處，呈寬基底，結(jié)節(jié)大小不一，邊緣可有分葉、毛刺、胸膜牽拉征，約40%結(jié)節(jié)周邊可伴有暈征，是肺隱球菌病相對特異性的影像學表現(xiàn)，但仍需與轉(zhuǎn)移瘤和原發(fā)性肺癌相鑒別。②浸潤實變型：多見于免疫功能低下者，表現(xiàn)為大片或斑片狀影，呈大葉性或節(jié)段性分布，少數(shù)患者可見支氣管充氣征，而聚集型分布、支氣管充氣征(多見于免疫功能正常者)是其相對特異性的CT影像可以與其他侵襲性真菌病鑒別。③混合型：常表現(xiàn)為多種形態(tài)和密度混合存在，多見于晚期播散性患者，易與肺結(jié)核相混淆。此外，約20%的患者伴有空洞性病變，多見于伴有HIV感染者，常呈局灶性、厚壁、偏心，內(nèi)壁光滑的空洞，也可見薄壁和(或)中心空洞[24]；有少數(shù)患者，可見腫大的肺門淋巴結(jié)，未見鈣化灶，肺間質(zhì)磨玻璃影和肺野散在的微小結(jié)節(jié)，需與原發(fā)性和(或)粟粒性肺結(jié)核相鑒別或存在伴發(fā)肺結(jié)核[25]；還有部分患者可見胸腔積液, 常伴有胸膜下肺結(jié)節(jié)，免疫功能低下者多見。

3.2隱球菌腦炎或腦膜腦炎CT 表現(xiàn)多樣，缺乏特異性，即可無異常，也可表現(xiàn)為雙側(cè)大腦半球和(或)基底節(jié)的腦實質(zhì)不規(guī)則低密度和(或)高密度灶，腦膜強化，腦水腫及腦室擴大等[26]。MRI在小型、輕度病變的部位、范圍、類型和評估嚴重程度及預(yù)后方面均優(yōu)于CT檢查[27-28]。MRI可表現(xiàn)為[29-30]：①平掃未發(fā)現(xiàn)異常，或出現(xiàn)腦溝、腦池線狀強化；②軟腦膜強化，最常見；③脈絡(luò)膜炎和室管膜炎，可見多發(fā)斑片狀或片狀的長T1長T2信號(雙側(cè)基底節(jié)及額、顳、頂葉)，增強掃描后病變呈片狀強化或無明顯強化；④肉芽腫，常見于雙側(cè)大腦半球，可見單發(fā)或多發(fā)類圓形T1WI呈低信號、T2WI呈高信號、增強后呈結(jié)節(jié)狀強化病灶，易誤診為肺癌腦轉(zhuǎn)移；⑤腦積水，可見輕至中度對稱性腦室擴張，多見于疾病中晚期。

4 隱球菌抗原檢測

抗原檢測是臨床診斷隱球菌病常用方法，可用于多種標本檢測，其靈敏性和特異性都較高，但不能區(qū)分基因型及隱球菌種類[31]。目前常用三種方法是：乳膠凝集試驗法(latex agglutination test, LA)和膠體金試驗法(lateral flow assay，LFA)以及酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。

4.1血清乳膠凝集試驗法(latex agglutination test，LA) 是以乳膠顆粒為載體，連接抗隱球菌莢膜多糖抗體，產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應(yīng)，當?shù)味取?∶8時為陽性診斷。LA具有快速、簡便、有效、并且優(yōu)于鏡檢法和培養(yǎng)法的優(yōu)點，但免疫功能正常者陽性率明顯低于免疫缺陷者。有研究證實，LA靈敏度和特異度分別為93%～100%和93%～98%，其診斷價值高，同時可評估療效和預(yù)后，但也存在假陽性和假陰性[32-34]。有文獻報道，一些技術(shù)性問題(洗滌反應(yīng)板被清潔劑及滑石粉污染標本)和一些感染問題(類風濕因子、巨球蛋白、毛孢子菌屬、曲霉菌和抗酸桿菌等的抗原易被誤檢測為莢膜多糖抗原)可導致試驗假陽性，但假陽性率較低，約為1%[16]。但有研究顯示，標本經(jīng)鏈霉蛋白酶和二硫蘇糖醇處理后，可以消除類風濕因子等干擾因子的干擾。而鉤帶現(xiàn)象(鉤帶現(xiàn)象是指抗原與抗體濃度比例不合適而導致凝集反應(yīng)不明顯)和體內(nèi)一些非特異性蛋白可掩蓋隱球菌抗原反應(yīng)，導致出現(xiàn)假陰性[35]。所以當只有單一的LA陽性結(jié)果時，不能草率的診斷隱球菌感染，需結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他實驗室檢查以診斷。但有人認為，免疫正常者LA陽性提示可能存在播散性感染[36]。

4.2膠體金試驗法即CrAg橫向流動測定法(lateral flow assay，LFA)，是一種夾心免疫層析試紙條試驗。LFA具有標本處理簡單，檢測方法快速(<15分鐘)，結(jié)果易讀等特點，可用于隱球菌感染高危者及HIV患者的預(yù)防性抗真菌治療前的篩查[37]。LFA與LA及酶聯(lián)免疫吸附測定法等的靈敏度及特異度高度一致，其還可檢測到一些其他血清學方法檢測為陰性的格特隱球菌[34,38-39]。但LAF檢測也存在假陰性和假陽性，比如疾病早期、血清抗原較少、溶血的血清樣本、極高濃度的抗原(>0.140 mg·mL-1)等均可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，如果在出現(xiàn)弱陽性或陰性，而又不除外前帶現(xiàn)象(前帶現(xiàn)象是指LFA檢測極高濃度的隱球菌抗原時，出現(xiàn)弱陽性或陰性)時，可進行半定量滴度檢測來排除假陰性[35]。隱球菌與曲霉菌存在交叉反應(yīng)，可導致假陽性結(jié)果，將標本稀釋后檢測可降低假陽性率。此外，LAF的靈敏度和特異度與檢測標本關(guān)系密切，血清和腦脊液標本靈敏度可達100%，特異度高達98%，但尿液標本靈敏度為70.7%～92%[40-41]。

4.3酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 以檢測隱球菌抗原和抗體滴度進行診斷，也可評估病情轉(zhuǎn)歸，即抗體滴度升高提示病情好轉(zhuǎn)。其靈敏度及特異度與前兩種抗原檢測相當，并也存在假陽性和假陰性[35,38-39]。既往隱球菌感染，隱球菌呼吸道定值均可導致假陽性。有研究顯示，ELISA檢測不同的標本陽性差異較大，尿液標本比血清或血漿陽性率低22倍。對于隱球菌孤立性病灶者，外周血或血清抗原檢測常為陰性，但檢測出高滴度陽性結(jié)果時，常意味著深部組織侵襲或存在播散可能。

5 病理學檢查

病理學檢查是診斷隱球菌病的金標準。典型的病理學特征為：可見小膿腫和凝固性壞死的非干酪性肉芽腫形成或形成趨勢，或膠樣病變。隱球菌菌體周圍存在大于菌體1～3倍的莢膜，被常用各種染色方法檢出[42]：墨汁染色、蘇木精-伊紅(HE)染色(因經(jīng)驗不足易導致漏診)、過碘酸.雪夫(PSA)染色、六胺銀染色(MGS)、奧爾辛藍(AB)染色和黏液卡紅(MC)染色等。有研究顯示[43]，PSA、MGS和AB染色對隱球菌的陽性檢出率分別為100%、97.4%和66.7%，但其他真菌感染時也顯示陽性，則缺乏特異性[44]。而MC染色特異性最好，一般MC染色陽性，可確診隱球菌病，但不能檢測出干性隱球菌，易出現(xiàn)假陰性，而黑色素可使干性隱球菌著色，所以當MC染色陰性時，可加做黑色素染色以鑒別[45]。有研究顯示，無論是新鮮標本還是甲醛固定的標本，電子顯微鏡對隱球菌莢膜的檢出率較高，約85%，但其費用較高，一般應(yīng)用于科研實驗研究[34-35]。雖然病理檢查是隱球菌病的金標準，但仍容易誤診或漏診，這是與標本取材(樣本較小，取材切面等)、真菌染色技術(shù)和病理醫(yī)生對隱球菌的警惕性不夠息息相關(guān)。

6 分子生物技術(shù)

近年來，分子生物技術(shù)在隱球菌分類、基因分型和診斷等研究中發(fā)展迅速，如染色體脈沖電泳、核酸探針技術(shù)、DNA指紋分類、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以及PCR結(jié)合其他技術(shù)等方法[46]。目前，PCR技術(shù)運用較多，因其具有簡便、準確、靈敏的特點，但特異性較低，而PCR實時熒光定量技術(shù)可彌補這一不足，但其擴增效率的高低會直接影響結(jié)果的準確性[16]。DNA探針技術(shù)可以對菌株變種分型，并進行DNA指紋分類，可運用核酸定位追蹤以進行流行病學調(diào)查，但其不能區(qū)分活菌與死菌。PCR指紋和多位點序列分型(MLST)可以鑒定隱球菌基因分型[9,47]，而且多位點微衛(wèi)星分型(MLMT)可以進一步區(qū)分MLST鑒定為基因分型相同的菌株[48-49]。近來發(fā)現(xiàn)，下一代多位點序列分型(NGMLST)和分析軟件程序(MLSTEZ)可實現(xiàn)高效、經(jīng)濟、高通量的多位點測序分型[50]，對流行病學調(diào)查研究和開發(fā)針對不同基因型進行特異性治療以及隱球菌耐藥與基因型是否相關(guān)等研究具有重要意義。

7 總結(jié)與展望

總之，目前診斷隱球菌感染首先通過一般實驗室檢查和影像學檢查進行初步篩查，再以檢測隱球菌抗原抗體的免疫學檢查進行診斷，而病理診斷仍為目前診斷隱球菌感染的金標準。分子生物技術(shù)可對隱球菌進行基因分型等。但我們目前缺乏對隱球菌早期感染的特異性診斷方法，而且缺乏鑒定格特隱球菌感染的診斷技術(shù)，常導致臨床格特隱球菌感染的漏診。此外臨床診斷不能區(qū)分隱球菌感染的種類、基因分型，不能在疾病早期明確診斷，從而不能早期進行針對性干預(yù)、降低死亡率。為此，我們應(yīng)該增強對隱球菌感染的認識，特別是HIV陰性隱球菌感染和格特隱球菌感染，并且開發(fā)對各種/各型的隱球菌早期或潛伏感染的特異性診斷方法，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，從而提高治愈率，降低死亡率。