汪希珂 綜述 田穎 審校

(貴州省人民醫(yī)院兒科心血管病區(qū)，貴州 貴陽(yáng) 550002)

先天性心臟病(CHD，簡(jiǎn)稱先心病)是胚胎時(shí)期心血管發(fā)育異常所致的心臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的異常。它是一類危害嬰幼兒生命健康的常見先天畸形，占嬰幼兒出生缺陷的首位，其發(fā)病率為活產(chǎn)嬰兒的6-8‰，死亡率在新生兒非感染性死亡中占首位約10‰[1]。先心病的病因尚不清楚，研究認(rèn)為，遺傳和環(huán)境因素共同參與了先心病的發(fā)生。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，先心病存在家族聚集現(xiàn)象，家族成員患病危險(xiǎn)度高于普通人群，并且與血緣關(guān)系遠(yuǎn)近相關(guān)，血緣關(guān)系越近，患病率越高。因此，對(duì)先心病遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制的研究是目前國(guó)內(nèi)外研究者聚焦的一大熱點(diǎn)。隨著人類基因組計(jì)劃的完成、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，先心病分子遺傳學(xué)研究取得了一定的共識(shí)。研究認(rèn)為先心病分子遺傳學(xué)機(jī)制復(fù)雜：?jiǎn)位蛲蛔?，多基因突變，染色體變異，基因組拷貝數(shù)變異都有可能導(dǎo)致心臟畸形的發(fā)生[4-5]。

1 基因突變與先天性心臟病

通過(guò)動(dòng)物模型的胚胎期心臟發(fā)育學(xué)研究發(fā)現(xiàn)心臟畸形的發(fā)生與基因突變相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)基因突變既可導(dǎo)致孤立型先心病，也可導(dǎo)致綜合征型先心病。目前，基因突變與先心病的研究主要通過(guò)對(duì)家系進(jìn)行連鎖分析和對(duì)大量無(wú)直接親緣關(guān)系的個(gè)體或小家系進(jìn)行連鎖不平衡分析兩種，通過(guò)從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中找到與先心病發(fā)生相關(guān)的位點(diǎn)基因，然后檢測(cè)候選基因的突變位點(diǎn)，從而最終發(fā)現(xiàn)致病基因。近年來(lái)，通過(guò)先心病家系的研究定位了一些與心臟發(fā)育相關(guān)的致病基因，包括TBX5，NKX2.5，GATA4，ZIC3，MYH6，NOTCH1，CRELD1，F(xiàn)OG2，等[6-7]。通過(guò)在散發(fā)先心病患者中進(jìn)行相關(guān)基因的突變篩查發(fā)現(xiàn)NKX2.5和GATA4基因突變可導(dǎo)致房(室)間隔缺損和房室傳導(dǎo)阻滯[8-9]。CRELD1突變導(dǎo)致孤立型(非綜合征)房室間隔缺損[13-14]，ZIC3突變導(dǎo)致伴有內(nèi)臟反位的復(fù)雜性先心病[10]，GATA-4突變導(dǎo)致房間隔缺損、室間隔缺損、法洛四聯(lián)癥等[11-12]，GATA-6突變導(dǎo)致永存動(dòng)脈干、法洛四聯(lián)癥等圓錐動(dòng)脈干畸形等[13-14]。截止目前，研究發(fā)現(xiàn)20多種致病基因突變導(dǎo)致散發(fā)或家族性孤立型先心病，而綜合征型先心病中發(fā)現(xiàn)的致病基因是孤立型先心病的兩倍多[5，15]。

雖然研究報(bào)道了越來(lái)越多參與調(diào)控心臟發(fā)育的基因突變與人類先心病發(fā)生相關(guān)，但對(duì)某個(gè)或某些基因突變是否引起先心病仍不能作出解釋。因?yàn)樵谏l(fā)先心病例中難以發(fā)現(xiàn)同樣的基因突變，即使在同一家系的不同成員中也可發(fā)生不同種類的心臟畸形。因此，其遺傳方式仍不明確，提示多基因參與調(diào)控的遺傳方式與環(huán)境相互作用的可能。

2 染色體異常與先天性心臟病

染色體異常主要包括非整倍體和微小缺失，是各種臨床綜合征最常見的病因。研究發(fā)現(xiàn)， 30%的染色體異常伴有心臟結(jié)構(gòu)畸形[16]。通過(guò)染色體G 顯帶核型分析，可以檢測(cè)出大部分染色體非整倍體異常：如Down氏綜合征(21-三體綜合征)，18-三體綜合征，13-三體綜合征等。其中，約 50% 的Down氏綜合征伴發(fā)心臟間隔缺損，包括房間隔缺損，室間隔缺損和房室間隔缺損，80%的13-三體綜合征伴發(fā)內(nèi)臟反位和心臟缺損；幾乎所有的18-三體綜合征都伴發(fā)以間隔缺損為主的先心病[17-18]。傳統(tǒng)染色體G 顯帶核型分析分辨率在5Mb 左右已在臨床診療工作中篩查出包括心臟畸形在內(nèi)的各種綜合征，隨著細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分辨率更高的技術(shù)將用來(lái)分析染色體異常。

熒光原位雜交技術(shù)(FISH)是細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)相結(jié)合的一種診斷技術(shù)。它是在原位雜交的基礎(chǔ)上，利用熒光染料標(biāo)記特異寡聚核苷酸片段作為探針，與待檢測(cè)染色體DNA分子進(jìn)行雜交，主要用于對(duì)染色體的定位。FISH技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了對(duì)染色體缺失和重復(fù)染色體異常的檢測(cè)靈敏度。其中，染色體缺失最典型的兩個(gè)病例是威廉姆斯綜合征和22qll.2微缺失綜合征。威廉姆斯綜合征是常染色體顯性遺傳疾病，主要表現(xiàn)為典型的面部特征，特殊心血管畸形，高鈣血癥，神經(jīng)發(fā)育異常及骨路、腎臟發(fā)育畸形。心血管畸形主要為主動(dòng)脈瓣上狹窄，肺動(dòng)脈狹窄和外周肺動(dòng)脈狹窄，約90%以上具有典型臨床表現(xiàn)的威廉姆斯綜合征患者可通過(guò)FISH檢測(cè)出來(lái)，其主要致病原因是染色體7qll.23區(qū)域基因的微缺失[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)7qll.23區(qū)域基因不同程度的缺失所導(dǎo)致的威廉姆斯綜合征臨床癥狀的嚴(yán)重程度也不盡相同，進(jìn)一步研究在此區(qū)域發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致該類綜合征心血管發(fā)育異常的基因即彈性蛋白基因(Elastin)，該基因突變可導(dǎo)致主動(dòng)脈或肺動(dòng)脈的發(fā)育異常，同時(shí)，在散發(fā)主動(dòng)脈瓣上狹窄患兒中也同樣發(fā)現(xiàn)該基因突變[20]。22qll.2缺失綜合征是一類由于染色體22qll.2發(fā)生微缺失而導(dǎo)致的疾病，包括DiGeorge綜合征，錐干面綜合征和腭心面綜合征，這類綜合征具有相同的遺傳基礎(chǔ)。包括典型的面容，腭裂，胸腺發(fā)育不全，心臟畸形及不同程度的認(rèn)知、交流和發(fā)育障礙等。并發(fā)心臟畸形主要為法洛四聯(lián)癥，肺動(dòng)脈閉鎖/室間隔缺損，永存動(dòng)脈干，主動(dòng)脈弓中斷等圓錐動(dòng)脈干畸形[21]。

由于FISH 技術(shù)受探針特異性的限制，只能使用已知位點(diǎn)探針檢測(cè)已知的染色體異常，不能用于發(fā)現(xiàn)新的染色體異常，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)是一種針對(duì)待檢DNA序列進(jìn)行定性和半定量分析的技術(shù)，由Schouten等在2002年首先報(bào)道[22]。該技術(shù)也應(yīng)用于人類基因片段的重復(fù)和缺失，MLPA能夠一次性對(duì)已知基因的所有外顯子進(jìn)行缺失和重復(fù)的篩查，在臨床診療中，遺傳性疾病、腫瘤、出生缺陷和先心病都得到廣泛的應(yīng)用[23-24]。但是，MLPA僅對(duì)已知的突變位點(diǎn)或區(qū)域的檢測(cè)，因此，需要有更為先進(jìn)的技術(shù)進(jìn)行染色體異常的檢測(cè)。

3 拷貝數(shù)變異與先天性心臟病

3.1拷貝數(shù)變異概念和發(fā)生機(jī)制 拷貝數(shù)變異(CNV)是由基因組發(fā)生重排而導(dǎo)致，它是指與參照基因組比較，長(zhǎng)度為1 kb 以上的基因組大片段的缺失、插入、重復(fù)、倒位和復(fù)雜多位點(diǎn)的變異，主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失和重復(fù)[25-26]。CNV廣泛存在于人類和其他哺乳動(dòng)物的基因組中，是遺傳差異的重要起源。CNV 的形成依賴于重組和復(fù)制為基礎(chǔ)的機(jī)制，CNV 產(chǎn)生的機(jī)制主要有非等位基因同源重組(NAHR)，非同源末端連接(NHEJ)。CNV通過(guò)各種分子機(jī)制，包括基因劑量、基因斷裂、基因融合、位置效應(yīng)等，導(dǎo)致了孟德爾遺傳規(guī)律性疾病，散在疾病或與其他復(fù)雜疾病的發(fā)生[27-28]。

3.2拷貝數(shù)變異檢測(cè)方法 目前，大多數(shù)CNV的研究是通過(guò)以下基因分析平臺(tái)來(lái)實(shí)現(xiàn)：微陣列比較基因組雜交技術(shù)(Array-CGH)、微陣列單核苷酸芯片技術(shù)(SNP-Array)和新一代測(cè)序技術(shù)。比較基因組雜交技術(shù)(CGH)是在FISH的基礎(chǔ)之上建立起來(lái)的，它是將目標(biāo)待測(cè)基因組與正常對(duì)照基因組用兩種不同的熒光染料標(biāo)記，按照相應(yīng)的比例混合后與正常人染色體雜交，用熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度，通過(guò)計(jì)算正常組和目標(biāo)組的熒光比率確定目標(biāo)基因組的DNA拷貝數(shù)的增減。

微陣列比較基因組技術(shù)(Array-CGH)由傳統(tǒng)CGH衍生，它將芯片技術(shù)利用在目標(biāo)DNA基因組檢測(cè)上，將DNA克隆或者cDNA做成微陣列代替?zhèn)鹘y(tǒng)CGH中的雜交靶，其分辨率較傳統(tǒng)CGH高出100倍以上，通過(guò)定位拷貝數(shù)變異精確的位置從而確定目標(biāo)基因。目前，用于Array-CGH檢測(cè)的芯片探針主要是PCR擴(kuò)增的BAC(細(xì)菌人工染色體)克隆和cDNA分子，較常用的是BAC克隆芯片，探針精度從最初的1Mb發(fā)展到目前應(yīng)用的25bp。而SNP-Array芯片技術(shù)是在Array-CGH基礎(chǔ)之上利用新的遺傳標(biāo)志—單核苷酸多態(tài)作為芯片發(fā)展而來(lái)的，通過(guò)比較目標(biāo)基因DNA片段的信號(hào)強(qiáng)度與其他個(gè)體的強(qiáng)度，從而確定每個(gè)位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的基因拷貝數(shù)目。SNP-Array與Array-CGH相比最大的區(qū)別是，SNP-Array芯片技術(shù)只需要目標(biāo)基因組DNA片段與探針進(jìn)行單雜交，而Array-CGH需同時(shí)對(duì)目標(biāo)基因組DNA片段和參考基因組進(jìn)行雜交。

同時(shí)，PCR技術(shù)是檢測(cè)目標(biāo)基因組區(qū)域是否存在拷貝數(shù)變異的基本技術(shù)，實(shí)時(shí)定量PCR(real time qPCR)能很好的對(duì)拷貝數(shù)缺失和重復(fù)進(jìn)行定量檢測(cè)，其準(zhǔn)確率高。但是， qPCR 通常只能對(duì)一個(gè)區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，近年來(lái)，應(yīng)用的短熒光片段多重 PCR(QMPSF)、多重?cái)U(kuò)增探針雜交(MAPH)和多重連接探針擴(kuò)增 (MLPA)等技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多達(dá)50個(gè)獨(dú)立區(qū)域，并且可以檢測(cè)傳統(tǒng)方法所不能檢測(cè)的所有外顯子缺失和重復(fù)。

此外，新一代測(cè)序技術(shù)和相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)策略，如Paired-end mapping(PEM)與基于測(cè)序技術(shù)的深度檢測(cè)分析方法也可以發(fā)現(xiàn)CNV并對(duì)其進(jìn)行精確定位[27，29-30]。但目前由于該技術(shù)因成本和可靠性等問(wèn)題還商未解決，故未得以廣泛開展。但是，這一分析策略方法將是今后高通量CNV 分析方法的發(fā)展方向。

3.3拷貝數(shù)變異與先天性心臟病的研究 隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，研究者對(duì)先心病相關(guān)致病基因及作用機(jī)制有了越來(lái)越多的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)。由于先心病種類繁多，致病基因眾多，各種類型先心病與相關(guān)基因之間的聯(lián)系和通路機(jī)制尚不清楚，并且CNV在先心病中的研究非常有限。2007年，Thienpont等應(yīng)用Array-CGH技術(shù)檢測(cè)了60例伴有心外畸形的綜合征型先心病患者，發(fā)現(xiàn)18例患者拷貝數(shù)變異，其患病率為30%；同時(shí)，在CNV缺失區(qū)域驗(yàn)證了過(guò)去研究發(fā)現(xiàn)與先心病發(fā)生相關(guān)的致病基因NKX2.5，NOTCH1，NSD1 和EHMT[31]。Breckpot等研究報(bào)道了150例綜合征型先心病患者中43例發(fā)生CNV，其中26個(gè)CNV被確定為致病性CNV[5]，該研究組報(bào)道了綜合征性先心病CNV比與非綜合征型先心病CNV高，其比值是19%：3.6%。Richards 等對(duì)20 例染色體核型正常的綜合征型 CHD 患者的研究中發(fā)現(xiàn)5名患者存在致病性CNV[32]。Erdogan等對(duì)105例孤立型先心病應(yīng)用BAC技術(shù)分析CNV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)18個(gè)致病性CNV[33]。Greenway等對(duì)114例孤立性法洛四聯(lián)癥患者進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)分析研究發(fā)現(xiàn)11個(gè)新的CNV，對(duì)非綜合征孤立性TOF發(fā)現(xiàn)CNV在1q21.1，3p25.1，7p21.3 和 22q11.2等區(qū)域，基于上述結(jié)果的發(fā)現(xiàn)，該研究認(rèn)為至少有10%的CNV是孤立性TOF的發(fā)生的病因[34]。另外，F(xiàn)akhro等對(duì)262名內(nèi)臟異位伴心臟畸形的患者及991名正常人進(jìn)行了CNV研究，結(jié)果在內(nèi)臟反位患者中發(fā)現(xiàn)了罕見CNV的增加，在這些CNV的獨(dú)特區(qū)域，研究者使用基因敲除方法在青蛙和非洲爪蟾進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，結(jié)果定位NEK2，ROCK2，TCGBR2，GALNT11，和NUP188等5個(gè)基因在打亂了生物體左向右發(fā)展模式，最終導(dǎo)致內(nèi)臟反位和心臟畸形[35]。Long Fei等對(duì)圓錐動(dòng)脈干畸形家系進(jìn)行CNV檢測(cè)發(fā)現(xiàn)8p23.1缺失，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在其8p23.1附近區(qū)域的SOX7基因重復(fù)，推測(cè)位于8號(hào)染色體的SOX7基因可能是在先心病發(fā)生的致病基因[36]。通過(guò)對(duì)基因組拷貝數(shù)變異在人類先心病中的研究，將有望尋找出新的致病基因，為易感基因的定位、克隆及基因表達(dá)的研究提供一定的理論基礎(chǔ)，可進(jìn)一步揭示先心病的發(fā)病機(jī)制。

4 展 望

先心病遺傳機(jī)制異常復(fù)雜，目前的研究已證實(shí)單基因突變、多基因突變、染色體變異以及近幾年基于芯片技術(shù)的CNV均可能導(dǎo)致先心病的發(fā)生，提示遺傳因素是先心病重要發(fā)病機(jī)制。隨著CNV在先心病中的研究和新的發(fā)現(xiàn)，將促進(jìn)對(duì)先心發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和了解，同時(shí)，隨著將來(lái)更加先進(jìn)和準(zhǔn)確的基因檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)，將有可能發(fā)現(xiàn)未知致病基因，這將進(jìn)一步加深對(duì)先心病分子遺傳學(xué)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為將來(lái)先心病的早期分子診斷、遺傳咨詢和治療開辟一條新的途徑。