魏冠棉，張軍偉，周鵬*

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

油腐乳是以大豆為原料經(jīng)磨漿、制坯、培菌、發(fā)酵而制成的發(fā)酵豆制品[1]。油腐乳因其營養(yǎng)豐富、質(zhì)地細(xì)膩、滋味鮮美和激發(fā)食欲等特點(diǎn)，成為深受云、貴地區(qū)人們喜愛的調(diào)味品和佐餐食品。食鹽在油腐乳生產(chǎn)過程中具有以下作用：通過滲透壓的作用降低油腐乳毛坯中的水分含量；為油腐乳提供咸味；抑制毛霉等有益微生物過度生長，尤其是抑制和防止雜菌和致病菌的生長；抑制后發(fā)酵過程中蛋白酶、脂肪酶等酶的活性，防止油腐乳的過度發(fā)酵而引起質(zhì)量問題[2]。雖然鹽在油腐乳生產(chǎn)過程中具有調(diào)味、抑菌等積極作用，但是高鹽與成人的高血壓癥、中風(fēng)、胃癌和腎病等疾病顯著相關(guān)[3]；此外，在發(fā)酵后期，油腐乳的鹽含量大于12 g/100 g腐乳，其過咸的口感大大地限制了消費(fèi)者的選擇[4]。而過低的鹽含量則會導(dǎo)致腐乳的質(zhì)地松散或腐敗變質(zhì)，從而引起腐乳的安全問題[5]。因此，制作低鹽含量的油腐乳很有必要。

近年來對腐乳的風(fēng)味研究越來越多，莊洋等[6-10]研究了不同的菌種和配料對腐乳的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響不盡相同，但腐乳揮發(fā)性風(fēng)味成分以酯類和醇類為主，其中酯類含量最多。雖然對腐乳風(fēng)味的研究很多，但針對低鹽發(fā)酵對油腐乳風(fēng)味影響的研究卻未見報道。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過低鹽發(fā)酵制備油腐乳，并對發(fā)酵過程中油腐乳的品質(zhì)和揮發(fā)性風(fēng)味進(jìn)行分析，為低鹽油腐乳的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

低鹽腐乳生產(chǎn)過程中的原輔料、半成品和成品：中國南方某腐乳生產(chǎn)企業(yè)；毛霉菌株：實(shí)驗(yàn)室保存菌株；酚酞、氫氧化鈉、硝酸銀、硫氰酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸鐵銨、甲醛、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、硫酸、硫酸銅和硫酸鉀：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑(上海)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HYL-C3搖床 太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DM2000生物顯微鏡 徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；BGZ-246電熱恒溫烘箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；T10 basic分散機(jī)、IKA-RO10攪拌器 德國IKA儀器設(shè)備有限公司；S220 Seven Compact pH/離子計 梅特勒-托利多公司；X08A自動消化裝置和K1302自動定氮分析儀 上海晟聲自動化分析儀器有限公司；Trace 1300 GC-MS色譜儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 油腐乳的制備與采集

大豆→浸泡→磨漿→豆?jié){→加入酸漿制備酸豆腐→切塊→白坯→接種毛霉→前發(fā)酵→毛坯→晾曬→鹽漬→腌制→裝瓶→后發(fā)酵→油腐乳。

在后發(fā)酵0，30，90天時，隨機(jī)收集不同鹽含量的油腐乳，11% SCF(對照組)、9% SCF、7% SCF和5%SCF各5瓶。

1.3.2 油腐乳理化指標(biāo)的測定

油腐乳中的水分含量采用直接干燥法測定，參照GB 5009.3—2010；總酸含量采用酸堿滴定法測定，參照GB/T 12456—2008；氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛值法測定，參照GB/T 5009.39—2003；水溶性蛋白的測定參照NY/T 1205—2006；氯化鈉含量采用間接沉淀法測定，參照GB/T 12457—2008。

1.3.3 油腐乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

樣品的前處理：取3 g研磨均勻的樣品于頂空進(jìn)樣瓶中，加入1 g氯化鈉、3 mL去離子水和25 μL內(nèi)標(biāo)物(100 mg/L苯甲酸乙酯)，混勻，密封。

固相微萃取程序：將樣品瓶置于60 ℃水浴中振蕩孵育10 min，頂空萃取20 min，萃取頭插入進(jìn)樣口后解吸5 min。

氣相條件：DB-WAX(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm)色譜柱；進(jìn)樣口溫度240 ℃；升溫程序：初始爐溫為40 ℃(保持2 min)，以10 ℃/min升至185 ℃(保持1 min)，再以10 ℃/min升到240 ℃(保持8 min)；載氣為氦氣，流速為1.5 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI；離子源溫度為230 ℃；掃描范圍為33～440 m/z，掃描速率為0.2 s/scan；電子能量為70 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 低鹽油腐乳發(fā)酵過程中品質(zhì)的變化

通過腐乳的成熟度判定腐乳成熟過程中品質(zhì)的動態(tài)變化；腐乳成熟度的判斷標(biāo)準(zhǔn)包括水分、總酸、氨基酸態(tài)氮、水溶性蛋白和食鹽含量[11,12]。

2.1.1 低鹽油腐乳發(fā)酵過程中水分含量的變化

圖1 低鹽油腐乳后發(fā)酵過程中水分含量的變化Fig.1 Changes of water content in low-salt oily fermented bean curd during post-fermentation

由圖1可知，在低鹽油腐乳后發(fā)酵90天過程中水分含量變化不顯著，這是由于油腐乳的水分在晾曬和鹽漬過程中幾乎達(dá)到平衡。低鹽發(fā)酵油腐乳的水分含量均小于75%，即符合中華人民共和國國內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10170-2007《腐乳》中腐乳成熟的理化要求。

2.1.2 低鹽油腐乳發(fā)酵過程中總酸含量的變化

腐乳的酸度主要由發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸、游離氨基酸、游離脂肪酸等形成。前發(fā)酵過程中，微生物分泌大量的糖化酶和脂肪酶，使白坯中的碳水化合物和脂肪分解成有機(jī)酸等；后發(fā)酵過程中，蛋白酶催化生成游離氨基酸。

圖2 低鹽油腐乳后發(fā)酵過程中總酸含量的變化Fig.2 Changes of total acid content in low-salt oily fermented bean curd during post-fermentation

由圖2可知，隨著后發(fā)酵時間的延長，總酸含量呈遞增趨勢。在后發(fā)酵30天過程中，5% SCF的總酸含量增長最為顯著，其總酸含量為2.29 g/100 g；7%和9% SCF的總酸增長速度次之，11% SCF的總酸增長最慢。在后發(fā)酵90天過程中，5% SCF的總酸含量趨于穩(wěn)定，7% SCF的總酸含量增加至2.35 g/100 g，9%和11% SCF的總酸含量緩慢增長。低鹽發(fā)酵油腐乳的總酸含量均小于2.5 g/100 g，即符合中華人民共和國國內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10170-2007《腐乳》中腐乳成熟的理化要求。由于低鹽油腐乳鹽含量降低，使得鹽對酶的抑制作用降低，從而易于油腐乳后發(fā)酵過程中水解反應(yīng)的進(jìn)行和有機(jī)酸、游離氨基酸、游離脂肪酸等的生成，因此低鹽油腐乳的總酸含量高于對照組(11% SCF)含量。

2.1.3 低鹽油腐乳發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化

氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，是判斷發(fā)酵產(chǎn)品發(fā)酵程度的特性指標(biāo)。它是由原料中的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的；指標(biāo)越高，則氨基酸含量越高，鮮味越好。

由圖3可知，隨著后發(fā)酵時間的延長，氨基態(tài)氮含量逐漸增加；低鹽油腐乳的氨基態(tài)氮含量增長速度大于對照組(11% SCF)的增長速度。由于油腐乳后發(fā)酵30天時，油腐乳中鹽含量較低，對酶的抑制作用相對較小，氨基態(tài)氮含量增長較快；此外，由于油腐乳中鹽含量的不同，酶解反應(yīng)受到的抑制作用不同，故氨基態(tài)氮含量增長速度不一致。隨著發(fā)酵時間的延長，油腐乳中鹽含量逐漸升高且達(dá)到平衡，導(dǎo)致酶的活性不同程度地降低，從而使得氨基態(tài)氮含量增長速度降低。低鹽發(fā)酵油腐乳的氨基態(tài)氮含量均大于0.5 g/100 g，即符合中華人民共和國國內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10170-2007《腐乳》中腐乳成熟的理化要求，表明降低鹽含量利于提高氨基酸態(tài)氮含量和加速油腐乳的成熟。

圖3 低鹽油腐乳后發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.3 Changes of amino nitrogen content in low-salt oily fermented bean curd during post-fermentqation

2.1.4 低鹽油腐乳發(fā)酵過程中水溶性蛋白含量的變化

水溶性蛋白質(zhì)和氨基態(tài)氮是腐乳中重要的風(fēng)味前體物質(zhì)，與腐乳品質(zhì)有著密切的關(guān)系。腐乳發(fā)酵過程中水溶性蛋白質(zhì)和氨基態(tài)氮均為蛋白質(zhì)水解程度的表征。

圖4 低鹽油腐乳后發(fā)酵過程中水溶性蛋白含量的變化Fig.4 Changes of water-soluble protein content in low-salt oily fermented bean curd during post-fermentation

由圖4可知，隨著后發(fā)酵時間的延長，水溶性蛋白含量逐漸增加，在后發(fā)酵90天時含量相近。由于油腐乳后發(fā)酵30天時，低鹽油腐乳中鹽含量較低，對蛋白酶的抑制作用相對較小，水溶性蛋白含量增長較快。隨著發(fā)酵時間的延長和蛋白水解反應(yīng)的進(jìn)行，水溶性蛋白含量趨于穩(wěn)定。低鹽發(fā)酵油腐乳的水溶性蛋白含量均大于3.2 g/100 g，即符合中華人民共和國國內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10170-2007《腐乳》中腐乳成熟的理化要求，表明降低鹽含量有利于提高水溶性蛋白含量和加速油腐乳的成熟。

2.1.5 低鹽油腐乳發(fā)酵過程中氯化鈉含量的變化

鹽在油腐乳發(fā)酵過程中的作用主要是：賦予油腐乳咸味；通過滲透壓的作用降低油腐乳中的水分含量；抑制后發(fā)酵過程中的酶活，防止過度發(fā)酵而引起質(zhì)量的問題；抑制毛霉等有益微生物過度生長，尤其是抑制和防止雜菌和致病菌的生長。

由圖5可知，隨著后發(fā)酵時間的延長，鹽含量先略微升高后趨于穩(wěn)定。鹽漬后毛坯的鹽含量為5.99 g/100 g，而腌制調(diào)料中鹽含量不同，使得毛坯和腌制調(diào)料的滲透壓不同，因此后發(fā)酵前期，毛坯吸收腌制調(diào)料中鹽的速度不一致。隨著后發(fā)酵時間的延長，滲透壓降低，油腐乳中鹽含量趨于穩(wěn)定。

圖5 低鹽油腐乳后發(fā)酵過程中氯化鈉含量的變化Fig.5 Changes of sodium chloride content in low-salt oily fermented bean curd during post-fermentation

2.2 低鹽油腐乳揮發(fā)性風(fēng)味含量的變化

表1 低鹽發(fā)酵油腐乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量Table 1 Content of volatile flavor compounds in low-salt oily fermented bean curd

續(xù) 表

由表1可知，通過GC-MS 方法分離鑒定出低鹽發(fā)酵油腐乳中揮發(fā)性風(fēng)味化合物77種：2種酚類、5種醛類、5種酮類、10種酸類、26種醇類、22種酯類和7種烷烴類；5種樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類相近，但含量有較大差異：酸豆腐中揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量為5542.44 μg/kg，其中醇類、酸類和酯類占的比例較大，分別為74.41%，9.02%，5.81%；低鹽油腐乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量顯著升高，11%，9%，7%，5% SCF揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量依次為21224.68，26898.17，34899.71，33548.01 μg/kg，其中酯類、醇類和醛類占的比例較大，分別為35.91%～41.78%，33.73%～43.11%和11.46%～22.76%。

酯類大多數(shù)具有特殊香氣，賦予了腐乳香甜氣味[13]。乙酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、辛酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、亞麻酸乙酯、苯乙酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、乙酸熏衣草酯、乙酸戊酯、乙酸異戊酯和乙酸芳樟酯賦予了油腐乳果香和花香；油酸乙酯、亞油酸乙酯和棕櫚酸乙酯賦予了油腐乳奶油香氣和酯香；水楊酸甲酯和棕櫚酸甲酯分別賦予了油腐乳草藥香氣和酯香[14]。油腐乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中乙酯類物質(zhì)含量較高，這與生產(chǎn)過程中乙醇的加入相關(guān)；在油腐乳發(fā)酵過程中，脂肪酸分解為游離脂肪酸，在酶的催化作用下游離脂肪酸與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成具有香氣的脂肪酸酯類物質(zhì)。

油腐乳中酸類、醇類和醛類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與發(fā)酵過程中物質(zhì)的分解代謝緊密相關(guān)。脂肪在油腐乳成熟過程中降解形成己酸、辛酸和油酸等游離脂肪酸，它們分別賦予了油腐乳奶油味、脂肪味和豬油氣味[15,16]；蛋白質(zhì)在蛋白酶作用下水解成游離氨基酸，苯丙氨酸(Phe)在酶的作用下分解代謝成苯乙醇，它賦予了油腐乳花甜香[17,18]；蛋白質(zhì)在蛋白酶作用下水解成游離氨基酸，苯丙氨酸(Phe)在酶的作用下分解代謝成苯甲醛，它賦予了油腐乳堅(jiān)果味。

3 結(jié)論

通過對11%，9%，7%，5%食鹽添加量的油腐乳后發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析，確定低鹽發(fā)酵能夠提高油腐乳的品質(zhì)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量。綜合油腐乳發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，7%和9%食鹽添加量可以用于油腐乳的實(shí)際生產(chǎn)。