王少銘，侯穎輝，劉濟(jì)明，冷家歸，李德文*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料研究所，貴陽(yáng) 550006；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料研究所， 貴陽(yáng) 550006；3.貴州大學(xué)，貴陽(yáng) 550006)

留蘭香(MenthaspicataLinn.)，又名綠薄荷、香薄荷、荷蘭薄荷、魚(yú)香菜，是一種唇形科直立多年生草本植物。莖、葉經(jīng)蒸餾可提取留蘭香精油，可入藥也可食用，在我國(guó)廣泛種植。薄荷的品種多樣，有常見(jiàn)的野生薄荷、歐薄荷、椒樣薄荷、蘋(píng)果薄荷和留蘭香薄荷等[1]，薄荷被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、洗護(hù)和化工等產(chǎn)業(yè)。薄荷精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌有明顯的抗菌活性[2]。薄荷提取物具有很強(qiáng)的抗氧化特性，尤其對(duì)清除超氧陰離子自由基能力和清除羥基自由基效果顯著。Kanatt S R等對(duì)薄荷提取物的研究也證實(shí)了其清除超氧化物和羥基的活性[3]。在西南地區(qū)，留蘭香薄荷和野生薄荷被人們采摘后直接食用。本研究主要對(duì)貴州地區(qū)(花溪區(qū)、興義市、畢節(jié)威寧、黔西南州和遵義市)的留蘭香精油進(jìn)行比較分析，同時(shí)對(duì)不同品種間——野生薄荷、留蘭香、小葉留蘭香和圓葉留蘭香精油進(jìn)行比較。

1 實(shí)驗(yàn)材料

留蘭香分別采自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)金竹鎮(zhèn)、興義市、畢節(jié)威寧、黔西南州安龍縣海星村和遵義市道真縣三江口鎮(zhèn)。野生薄荷、小葉留蘭香和圓葉留蘭香分別采自興義市、花溪區(qū)和安順普定。

1.1 留蘭香精油提取

采摘留蘭香地上莖、葉部分，準(zhǔn)確稱(chēng)取200 g剪成1 cm左右，加入蒸餾水1 L，水蒸氣提取法提取3 h，利用水蒸氣蒸餾法提取精油。并加入無(wú)水硫酸鈉吸收多余水分后，取50 μL精油溶于950 μL正己烷(色譜純，美國(guó)MREDA公司)中，充分混勻備用。精油得率計(jì)算方法為：精油體積(mL)/薄荷用量(g)×100%。

1.2 精油成分分析

氣相條件：Agilent 7890A；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣量：0.5 μL；分流比：50∶1。色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣(He)：0.8 mL/min。色譜柱程序升溫：初溫60 ℃，以2 ℃/min，的速度從60 ℃升至180 ℃，再以15 ℃/min的速度從180 ℃升至290 ℃，保持15 min。

質(zhì)譜條件：Agilent 5975C質(zhì)譜儀；EI離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度200 ℃；掃描范圍：35～450 amu全掃描。用氣質(zhì)聯(lián)用儀分離樣品成分，再通過(guò)檢索NIST11化學(xué)工作站標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)，使用MS軟件進(jìn)行譜庫(kù)搜索，得到一個(gè)按匹配度由高到低排列的化合物匹配列表，鑒定組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。采用面積歸一法確定各主要組分的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果分析

2.1 精油得率

幾種薄荷精油得率存在顯著差異，見(jiàn)表1。

表1 留蘭香精油得率Table 1 Essential oils' yield of Mentha spicata %

由表1可知，遵義道真縣與花溪區(qū)留蘭香精油含量明顯高于興義、畢節(jié)和黔西南州地區(qū)種植的留蘭香樣品。小葉留蘭香比圓葉留蘭香精油含量略高，但均低于花溪與遵義地區(qū)的留蘭香。興義的野生薄荷品種精油含量明顯高于當(dāng)?shù)亓籼m香。由此可以得出同一留蘭香品種在不同地區(qū)間精油的含量比較：遵義道真>花溪區(qū)>黔西南州>畢節(jié)威寧>興義市；不同品種間含量比較：野生薄荷>留蘭香>小葉留蘭香>圓葉留蘭香。

2.2 留蘭香精油組分分析

留蘭香精油組分分析見(jiàn)表2。

采用GC/MS法對(duì)8個(gè)精油樣品進(jìn)行分析共得到85種物質(zhì)，其中在花溪區(qū)、興義市、畢節(jié)、黔西南和遵義5個(gè)地區(qū)留蘭香精油中分別得到38，44，45，47，23種物質(zhì)；在野生薄荷精油中得到26種物質(zhì)；在小葉留蘭香精油中共得到24種物質(zhì)；在圓葉留蘭香精油得到44種物質(zhì)。通過(guò)比較貴州5個(gè)地區(qū)(花溪區(qū)、興義市、畢節(jié)、黔西南和遵義)留蘭香莖、葉精油組分發(fā)現(xiàn)，黔西南和遵義地區(qū)與其他地區(qū)差異較大，花溪區(qū)、興義市、畢節(jié)威寧地區(qū)該品種精油組分的相似度很高，且均以香芹酮為主，含量分別高達(dá)66.28%，53.29%，53.49%；黔西南州和遵義市則分別以香芹醇和薄荷腦為主；小葉留蘭香和圓葉留蘭香與花溪等地區(qū)相似，主要成分也是香芹酮，含量分別達(dá)到76.67%，30.81%，其中前者香芹酮含量為8個(gè)樣品中最高。

5個(gè)不同地區(qū)留蘭香精油樣品中的共有物質(zhì)有11種，包括β-月桂烯、3-辛醇、d-檸檬烯、反式-β-羅勒烯、芳樟醇、香芹酮、β-波旁烯、石竹烯、右旋大根香葉烯、(2E,4S,7E)-4-異丙基-1,7-二甲基環(huán)十二碳-2,7-二醇和α-畢橙茄醇，幾種成分分別占5種精油中總香氣成分的81.11%，74.42%，78.51%，24.0%，6.02%。遵義市道真縣留蘭香精油中共有成分占比最低，也表明該樣品與其他樣品的差異較大?；ㄏ獏^(qū)、興義市和畢節(jié)3個(gè)地區(qū)的留蘭香精油中的共有組分有29種，除以上11種外，還包括桉樹(shù)腦、2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-環(huán)己醇、反式-2-甲基-5-(1-甲基烯乙基)-環(huán)己酮、3-甲基-6-(1-甲基烯乙基)-2-環(huán)己-1-醇、2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己-1-醇、反式-8-對(duì)孟烯-2-醇乙酸酯、醋酸正丙酯、(Z)-3-甲基-2-(2-戊二?；?-2-環(huán)戊烯-1-酮、(E)-β-金合歡烯、2-異丙基-5-甲基-9-亞甲基-雙環(huán)[4.4.0]十二-1-烯、[1R- (1.α,2. α,3.β,6.α)]-3-乙?；?3-甲基-2-(1-甲烯丙基)-6-(1-甲基乙基)-環(huán)己醇、彌羅松酚等。29種共有組分分別占其精油總量的94.45%，92.1%，93.5%，由此也用可看出花溪區(qū)、興義市和畢節(jié)這3個(gè)地區(qū)的留蘭香品種間具有很近的親緣關(guān)系。

比較不同品種間留蘭香的異同，發(fā)現(xiàn)留蘭香、野生薄荷、小葉留蘭香和圓葉留蘭香在精油組成上差異較大。小葉留蘭香和圓葉留蘭香中主要成分與留蘭香相同，均為右旋香芹酮，但是含量差異較大，分別為76.67%，30.81%，野生薄荷中則只有0.33%。不同品種間共有的成分只有4種(香芹酮、β-波旁烯、石竹烯和右旋大根香葉烯)。

本研究也從精油組分的角度證明了不同樣品間的親緣關(guān)系與之前本實(shí)驗(yàn)室利用SRAP與ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)貴州33份薄荷種質(zhì)資源進(jìn)行聚類(lèi)分析的結(jié)論一致，8種薄荷樣品中畢節(jié)威寧、花溪區(qū)和興義市3個(gè)地區(qū)的親緣關(guān)系最近，其次依次為黔西南安龍和遵義地區(qū)。

表2 貴州不同地區(qū)、不同品種留蘭香精油成分比較Table 2 Comparison of essential oils' components of different varieties of Mentha spicata from differemt areas of Guizhou %

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

注：“-”表示未檢測(cè)出。

3 討論

不同地區(qū)的同一品種留蘭香以及不同品種間精油成分有明顯差異。造成該差異的原因主要有兩種：一是自身基因差異和基因表達(dá)差異。其中基因表的差異有可能是自身編碼合成精油組分的基因不同，現(xiàn)變?yōu)榫徒M分的差異。不同地區(qū)間的同一種留蘭香由于長(zhǎng)期處于不同的環(huán)境中導(dǎo)致其基因存在一定的差異，但相比其他品種，親緣關(guān)系較近。另一種原因可能是外界某種物質(zhì)的影響使原本基因型相同的薄荷品種產(chǎn)生不同的表現(xiàn)型，也會(huì)使精油組分產(chǎn)生差異。如陳小華[4]研究發(fā)現(xiàn)脫落酸處理能夠顯著影響薄荷精油合成相關(guān)基因的表達(dá)。另外，不同采收期對(duì)薄荷精油的含量及成分含量也有一定影響。一定功率的微波輻射可以提高薄荷精油的提取率，同時(shí)，不同的料液比和不同的處理時(shí)間對(duì)精油提取率也有一定影響[5]。不同濃度的氮、磷、鉀和不同氮素形態(tài)配比處理對(duì)薄荷精油的含量以及精油成分的相對(duì)含量影響顯著[6]。如果葉綠素缺乏，薄荷其還原草酸酶mRNA或酶活性低，產(chǎn)生的精油會(huì)比野生薄荷少[7]，而精油的數(shù)量和組成也可以通過(guò)代謝工程來(lái)調(diào)節(jié)。薄荷精油的合成機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

貴州不同地區(qū)和不同品種間薄荷精油組分差別比較大，其香氣成分以香芹酮為主，周露研究發(fā)現(xiàn)云南野生薄荷精油的主要成分為薄荷醇，葉蘭榮等[8]研究發(fā)現(xiàn)黑胡椒薄荷、薰衣草薄荷、菠蘿薄荷和留蘭香精油的主要成分分別為薄荷醇、芳樟醇和氧化胡椒烯酮。香芹酮具有趨避淡色庫(kù)蚊雌成蚊的活性，具備被開(kāi)發(fā)為植物源衛(wèi)生害蟲(chóng)防控劑的潛力[9]。因此，可以發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)、不同品種薄荷精油組分差異較大。