劉翔，鄒恒，鄧小峰，鄭硯文，顏世超，侯旭陽，熊力，李清龍

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙 410011）

膽管癌（cholangiocarcinoma）是來源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，發(fā)生率占全部惡性腫瘤的比例低于1%，其發(fā)病隱匿，惡性程度高，預(yù)后較差[1-2]，目前治療膽管癌的方式包括手術(shù)切除、放療、化療及生物靶向治療等，由于膽管癌早期癥狀不典型，多數(shù)患者就診時(shí)已喪失根治手術(shù)機(jī)會，預(yù)后差，中位生存期不足1年[3]。對晚期的膽管癌患者來說，現(xiàn)有的臨床姑息性治療手段很難延長患者的生存時(shí)間及改善其生活質(zhì)量。

光動力治療（photodynamic therapy，PDT），是指利用特定波長的激光照射光敏劑，其受激發(fā)產(chǎn)生包括單線態(tài)氧在內(nèi)的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受損乃至死亡[4]。PDT對膽管癌患者來說是一種新型的治療手段，臨床實(shí)踐表明PDT可用于不可手術(shù)膽管癌患者的輔助治療，其能夠有效恢復(fù)膽管引流、減少膽汁淤積，降低膽紅素血清水平、改善生活質(zhì)量、延長其生存時(shí)間[5-7]。 目前臨床所使用的光敏劑多為第一代光敏劑，其在腫瘤部位富集濃度較低，產(chǎn)生皮膚毒性反應(yīng)較明顯，光動力殺傷效應(yīng)較差，故探索一種能高濃度聚集于腫瘤部位并毒性低的光敏劑已成為臨床P D T 發(fā)展趨勢。方啟程團(tuán)隊(duì)[8]通過研究提純并自主合成了一種新型光敏劑華卟啉鈉（sinoporphyrin sodium，DVDMS），其具有產(chǎn)率高、水溶性大、容易純化等特點(diǎn)，且有研究[9]表明DVDMS介導(dǎo)的PDT（DVDMS-PDT）對人肝癌細(xì)胞H e p G 2、人肺癌細(xì)胞H 4 6 0、人胃癌細(xì)胞BGC823和人腎癌細(xì)胞Ketr-3均有明顯的生長抑制作用，國內(nèi)外暫無DVDMS 應(yīng)用于膽管癌細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道。脂質(zhì)體是一種新型藥物載體，具有提高藥物的療效，生物相容性高，減少藥物的毒副反應(yīng)等特點(diǎn)，已被美國食品藥品監(jiān)管局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)臨床應(yīng)用。本文采用薄膜水化-超聲法制備脂質(zhì)體華卟啉鈉（DVDMS-L），研究其表征，并比較DVDMS-L與DVDMS在體外對膽管癌細(xì)胞的光動力殺傷效應(yīng)，以作為新的抗膽管癌光敏劑應(yīng)用于臨床，提供有價(jià)值的臨床資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

⑴ 細(xì)胞系：膽管癌HICC-9810細(xì)胞系（購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心）。⑵ 試劑：二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）（Avanti公司，美國），膽固醇（Avanti公司，美國），磷脂酰乙醇胺甲氧基聚乙二醇2000（DSPE-mPEG-2000）（Sigma-Aldrich 公司，美國），華卟啉鈉（江西青龍高科技股份有限公司提供，中國），717型陰離子交換樹脂（天津津達(dá)樹脂廠，中國），CCK8 試劑（Sigma-Aldrich公司，美國），DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），胎牛血清（Hyclone公司，美國）。⑶ 儀器設(shè)備：R2205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BMCHI公司，瑞典），LD630半導(dǎo)體激光光動力儀（深圳雷邁公司，中國），JY922D型超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝科技有限公司，中國），電子分析天平（島津公司，日本），JEOLJEM透射電鏡（JEO公司，日本），UV-2550型紫外-可見光分光光度計(jì)（島津公司，日本），Zetasizer Nano-S90型激光納米粒度分析儀（Malvin公司，英國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DVDMS-L 的制備 采用薄膜分散- 超聲法[10-12]制備DVDMS-L：分別精確稱取DPPC、膽固醇、DSPE-mPEG2000 20 mg、5 mg、5 mg，以8 mL 甲醇徹底溶解，移入50 mL 圓底燒瓶中，在45 ℃、100r/min 條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至燒瓶內(nèi)壁形成一層均勻的薄膜，4 ℃抽真空過夜，以含DVDMS 0.5 mg 的生理鹽水5 mL 水化，水化溫度55 ℃，水化時(shí)間1 h，得到脂質(zhì)體混懸液，超聲細(xì)胞粉碎儀以400 mW 功率超聲10 min，并依次擠壓通過450 nm、220 nm 的聚碳酸酯膜，得澄清透明的DVDMS-L 溶液（以上操作均嚴(yán)格避光）。

1.2.2 DVDMS-L 表征測定 以Zetasizer Nano-S90型激光納米粒度分析儀測定DVDMS-L 的粒徑及Zeta 電位；以磷鎢酸負(fù)染法[11,13]處理DVDMS-L樣品，通過透射電鏡觀察DVDMS-L 的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和粒徑分布。

1.2.3 DVDMS-L 包封率測定 精確稱取一定量的DVDMS，甲醇溶解，配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液；空白脂質(zhì)體以甲醇破乳并稀釋，配制空白溶液；DVDMS-L以甲醇破乳并稀釋，配制對照品溶液。對以上標(biāo)準(zhǔn)品溶液、空白溶液、對照品溶液分別行200～700 nm波長范圍掃描，得DVDMS 紫外最大吸收峰位于387 nm 附 近。 精 確 配 制6.25、3.125、1.563、0.781、0.39、0.195 mg/L 的DVDMS 甲 醇 溶 液，分別在387 nm 處測紫外吸光度，以吸光度（Y）對DVDMS 質(zhì)量濃度（X，mg/L）作線性回歸方程。采用陰離子交換樹脂- 微柱離心法[14]測定DVDMS-L 包封率：常規(guī)活化717 型陰離子交換樹脂，移入2.5 mL 注射器針筒，1 000r/min 離心 2 min，制成微柱；取100 μL 空白脂質(zhì)體（同樣以薄膜分散- 超聲法制備，只是用不含DVDMS 的生理鹽水水化），滴至微柱頂端中央，靜置5 min，2 000r/min 離心2 min，再以100 μL 生理鹽水洗脫，2 000r/min 離心2 min，重復(fù)4 次，分別收集每次洗脫液，甲醇破乳定容至5 mL，濁度法[15]測定各次洗脫液于450 nm 處吸光度（A1，A2，A3，A4）；另取100 μL 空白脂質(zhì)體，直接甲醇破乳定容至5 mL，于450 nm 處測定吸光度（A0），空白脂質(zhì)體回收率按公式Σ（An/A0）×100%計(jì)算（n=1，2，3，4）。取100 mg/L 的DVDMS 水溶液取100 μL 滴至微柱頂端中央，按前述操作洗脫4 次，分別收集每次洗脫液，甲醇稀釋并定容至5 mL，于387 nm 處測吸光度，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)化為濃度（C1，C2，C3，C4）；另 取100 mg/L 的DVDMS 水 溶 液取100 μL，直接甲醇定容至5 mL，于387 nm 處測吸光度，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)化為濃度（C0），游離DVDMS 吸附率按公式1-Σ（Cn/C0）×100% 計(jì)算（n=1，2，3，4）。取100 μL DVDMS-L 滴 至 微柱頂端中央，按前述操作洗脫4 次，收集全部洗脫液，以甲醇破乳并定容至5 mL，于387 nm 處測吸光度，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成濃度，記為Cin；另取100 μL DVDMS-L 以甲醇破乳并定容至5 mL，于387 nm 處測吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成濃度，記 為Ctotal； 包 封 率（encapsulation efficiency，EE）按公式下述公式計(jì)算：EE=Cin/Ctotal×100%。按此方法重復(fù)3 次，計(jì)算平均包封率。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 人膽管癌HICC-9810 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（含1%雙抗）中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，2 d換液1 次，3～4 d 傳代1 次。

1.2.5 DVDMS-L 光動力效應(yīng)檢測 將膽管癌HICC-9810 細(xì)胞以104個(gè)/ 孔的密度均勻種于96孔板中，待每孔長滿細(xì)胞，分別用0、0.06、0.12、0.25、0.5、1 μmol/L 的DVDMS-L 與DVDMS，加10 J/cm2光照，每個(gè)濃度設(shè)置4 個(gè)副孔，孵育HICC-9810 細(xì)胞4 h。同時(shí)用相同條件以上濃度的DVDMS-L 與DVDMS 但無光照，以及10 J/cm2光照但無光敏劑處理HICC-9810 細(xì)胞，觀察單純光敏劑與單純光照的作用。孵育4 h 后以630 nm 的激光照射各孔，光照后繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，以CCK8 法[16]通過多功能酶標(biāo)儀（波長570 nm）測定各孔OD 值，細(xì)胞存活率按下述公式計(jì)算：細(xì)胞存活率= 處理組OD 值/ 完全空白組OD 值×100%；Bliss 法[17]計(jì)算半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration 50，IC50）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)及方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DVDMS-L 性狀

所制備出的DVDMS-L呈紅色透明澄清溶液，如圖1所示。

圖1 DVDMS-L 外觀Figure 1 Appearance of DVDMS-L

2.2 DVDMS-L 表征

DVDMS-L平均粒徑為（113.7±14.2）nm，粒徑分布指數(shù)（PDI）為0.142（圖2A）；DVDMS-L平均Zeta電位為-（24.5±3.2）mV（圖2B）；DVDMS-L在透射電鏡下呈圓形或橢圓形，粒徑分布與激光粒度分析儀結(jié)果一致，可觀察到脂質(zhì)體雙分子層結(jié)構(gòu)（圖2C）。

圖2 DVDMS-L 表征檢測 A：DVDMS-L 粒徑分布；B：DVDMS-L Zeta 電位；C：DVDMS-L 透射電鏡圖Figure 2 Characterization of DVDMS-L A: Particle size distribution of DVDMS-L; B: Zeta potential of DVDMS-L; C:Transmission electron microscopy of DVDMS-L

2.3 DVDMS-L 包封率

DVDMS標(biāo)準(zhǔn)曲線：以DVDMS甲醇溶液于387nm處吸光度（Y）對其質(zhì)量濃度（X，m g/L）作線性回歸方程，得回歸方程：Y=0.16671X+0.006336，r2=0.9998，表明DVDMS在0.195～6.25 mg/L的濃度范圍內(nèi)其吸光度線性關(guān)系良好（圖3）。空白脂質(zhì)體回收率：每次洗脫后空白脂質(zhì)體的回收率分別為72.1%、88.2%、9 7.4%、9 9.5%，可認(rèn)為洗脫4 次后空白脂質(zhì)體完全從陰離子交換樹脂微柱上洗脫下來。游離DVDMS吸附率：每次洗脫后游離DVDMS的吸附率分別為99.7%、99.7%、99.5%、99.4%，可認(rèn)為 4次洗脫內(nèi)游離DVDMS被陰離子交換樹脂微柱完全吸附，不能洗脫下來。

結(jié)合以上結(jié)果可知，洗脫4 次能將脂質(zhì)體完全洗脫下來，而未包裹的藥物不會被洗脫，故該方法能實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體與未包裹藥物完全分離。計(jì)算出DVDMS-L平均包封率為（61.74±1.49）%（n=3）。

圖3 DVDMS 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve of DVDMS

2.4 光動力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

光照條件下，DVDMS 與DVDMS-L 在達(dá)到0.25 μmol/L后均能引起HICC-9810細(xì)胞明顯死亡，細(xì)胞存活率與光敏劑呈濃度依賴性關(guān)系，隨著藥物濃度升高，兩組細(xì)胞存活率逐漸減少，每組內(nèi)各濃度之間存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；當(dāng)藥物濃≥0.12 μmol/L后，同一濃度DVDMS-L組較DVDMS組細(xì)胞存活率明顯減少（均P＜0.05）（圖4）；DVDMS-L IC50為0.11 μmol/L，DVDMS IC50為0.29 μmol/L，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，在無光照條件下，任何濃度DVDMS與DVDMS-L，或無光敏劑單純光照對HICC-9810細(xì)胞均無殺傷作用（均P＞0.05）。

圖4 DVDMS 與DVDMS-L 對HICC-9810 細(xì)胞活力的影響Figure 4 Effects of DVDMS and DVDMS-L on viability of HICC-9810 cells

3 討 論

為增加抗腫瘤藥物的生物利用度，降低毒性、增加生物相容性，國內(nèi)外研究出多種載藥系統(tǒng)，如納米有機(jī)多聚物顆粒[18]、納米脂質(zhì)體[19]、量子點(diǎn)[20]、上轉(zhuǎn)換納米顆粒[21]等，本實(shí)驗(yàn)選用脂質(zhì)體作為DVDMS的載藥系統(tǒng)，并通過查詢相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]及大量預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步摸索出制備DVDMS-L最佳處方及制備工藝，并選擇薄膜超聲-水化法作為脂質(zhì)體的制備方法，在該條件下所制備出的DVDMS-L性狀穩(wěn)定，重復(fù)性好，包封率可觀。包封率是評價(jià)脂質(zhì)體質(zhì)量的指標(biāo)之一[22]，預(yù)實(shí)驗(yàn)中，作者曾使用超濾離心法[23]、魚精蛋白沉淀法[24]、低溫超速離心法[25]、葡聚糖凝膠柱法[26]等常見包封率測定方法，均不能實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體與藥物完全分離，從而不能準(zhǔn)確計(jì)算包封率。超濾離心法中超濾膜對DVDMS有一定程度的吸附和截留；魚精蛋白沉淀法中魚精蛋白對DVDMS 亦有吸附；低溫超速離心法數(shù)據(jù)重復(fù)性低，對設(shè)備要求高；葡聚糖凝膠柱法耗時(shí)長，成本較高，對脂質(zhì)體樣品過度稀釋，且得不到脂質(zhì)體與未包封藥物良好分離的洗脫曲線，故無法得到較為準(zhǔn)確的包封率。本研究最終采用陰離子交換樹脂-微柱離心法測定DVDMS-L 的包封率，該法操作相對簡單，耗時(shí)較短，對樣品無過度稀釋，成本較低，能實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體與未包裹的藥物完全分離，最終計(jì)算出包封率為（61.74±1.49）%，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的結(jié)果較為接近。粒徑及其分布為評價(jià)脂質(zhì)體質(zhì)量的另一個(gè)指標(biāo)[27]。研究[27]表明粒徑＞400 nm的脂質(zhì)體易于被巨噬細(xì)胞捕獲繼而從血液循環(huán)中被清除，而粒徑＜200 nm的脂質(zhì)體能在血液循環(huán)中保留較長時(shí)間，本研究中所制備的DVDMS-L平均粒徑為（113.7±14.2）nm，PDI為0.142，說明該脂質(zhì)體粒徑分布較為均勻，且達(dá)到納米脂質(zhì)體的要求。

PDT經(jīng)多年不斷發(fā)展，如今越來越被重視和研究。本實(shí)驗(yàn)使用膽管癌HICC-9810細(xì)胞株，進(jìn)行了光毒性實(shí)驗(yàn)、暗毒性實(shí)驗(yàn)，并對比了不同藥物濃度下DVDMS-L與DVDMS對HICC-9810膽管癌細(xì)胞的光動力殺傷效應(yīng)。結(jié)果顯示，無光敏劑條件下，單純光照并不造成膽管癌細(xì)胞的明顯死亡；無光照條件下，在本研究的濃度范圍內(nèi)單純光敏劑亦不能造成膽管癌細(xì)胞的明顯死亡，說明光敏劑和光照為PDT兩個(gè)必需的條件，缺一不可，且本研究的光敏劑濃度范圍對膽管癌細(xì)胞不具備暗毒性，在無光照時(shí)可視為安全濃度范圍。光照條件下，隨著光敏劑濃度的增加，兩組的細(xì)胞存活率逐漸降低，表現(xiàn)出濃度依賴性的趨勢；光敏劑濃度達(dá)0.12 μmol/L后在同一濃度下，DVDMS-L相較于DVDMS表現(xiàn)出對HICC-9810膽管癌細(xì)胞更強(qiáng)的光動力殺傷效應(yīng)，可能原因如下：DVDMS經(jīng)脂質(zhì)體包裹后，其對膽管癌細(xì)胞有更大親和力，被膽管癌細(xì)胞攝取的量更大，產(chǎn)生的ROS更多，從而對膽管癌細(xì)胞殺傷作用更明顯。這些可能的機(jī)制需要通過細(xì)胞對光敏劑攝取相關(guān)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)ROS測定實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證，而作者暫未進(jìn)行此類實(shí)驗(yàn)，是本文的不足之處之一，故在今后的研究中需要進(jìn)行此類實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證DVDMS脂質(zhì)體化的效果。

手術(shù)治療是臨床治療膽管癌的主要方式，但多數(shù)患者被診斷為膽管癌時(shí)已失去根治手術(shù)機(jī)會，且膽管癌對放化療并不敏感，故膽管癌的總體預(yù)后較差，患者生存期短、生活質(zhì)量較低[1,28-29]。PDT的臨床應(yīng)用為膽管癌的臨床治療帶來希望，尤其是無法手術(shù)切除的膽管癌患者，PDT能緩解膽道梗阻，延長患者壽命，提高生活質(zhì)量[5-7]。PDT于2015年已被美國NCCN指南納入膽管癌臨床治療的手段之一[30]，PDT治療膽管癌前景廣闊。本文使用HICC-9810膽管癌細(xì)胞系，脂質(zhì)體化的DVDMS進(jìn)行PDT研究，旨在為臨床PDT治療膽管癌提供更多依據(jù)，為今后攻克膽管癌這一難題打下基礎(chǔ)。遺憾的是，本研究僅進(jìn)行了PDT殺傷膽管癌的體外研究，缺少動物實(shí)驗(yàn)，今后的研究中必須開展光動力治療膽管癌的體內(nèi)研究。今后還可以開展DVDMS-L對膽管癌細(xì)胞光動力殺傷作用的分子機(jī)制研究，進(jìn)一步深入探索DVDMS-L對膽管癌細(xì)胞光動力殺傷作用的本質(zhì)。