許婧怡，張 帆，2*

(1.北京信息科技大學(xué)光電測試技術(shù)及儀器教育部重點實驗室，北京 100192；2.北京信息科技大學(xué)先進(jìn)光電子器件與系統(tǒng)創(chuàng)新引智基地，北京 100192)

細(xì)胞是生物體基本的結(jié)構(gòu)和功能單元，始終處于不同的力學(xué)環(huán)境中[1-2]。 細(xì)胞能感知其周圍的力學(xué)刺激，如細(xì)胞外基質(zhì)剛度、拉壓應(yīng)力、流體剪切應(yīng)力等，并對所受刺激做出響應(yīng)。 對于在體外研究細(xì)胞響應(yīng)來說，包括兩個方面，一方面是對細(xì)胞施加力學(xué)刺激，另一方面是對其做出的響應(yīng)進(jìn)行觀測。

迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了各種微機電系統(tǒng)(MEMS)用于研究細(xì)胞對機械刺激的響應(yīng)[3]，在開發(fā)的各種MEMS 器件中，由聚合物或復(fù)合材料制備而成的微柱器件，因其可控性好，所需的圖像處理與力學(xué)模型較為簡單，并且生物兼容性較好[4-6]，而在微納米技術(shù)研究中獲得了極大的關(guān)注[7-8]，成為細(xì)胞力學(xué)領(lǐng)域最有潛力的方法之一[9]。 微柱器件大部分由微米到納米級的微柱陣列組成，可以分為兩種不同的類別，第一類是無源微柱陣列，即器件上沒有驅(qū)動機構(gòu)，它主要用作傳感器件；第二類是可驅(qū)動微柱陣列，即可同時作為驅(qū)動器件和傳感器件使用，由于磁性材料受環(huán)境限制較小[10]，所以現(xiàn)在大多數(shù)可驅(qū)動聚合物微柱陣列都是采用磁性驅(qū)動的[3]。 磁性微柱陣列的制備大致可分為溶劑型鑄造技術(shù)法[8]、納米線沉積法[11-12]和干性納米顆粒法[8]。 但現(xiàn)有的磁性微柱陣列制備方法仍存在一些問題。 其中溶劑型鑄造技術(shù)是制備磁性聚合物結(jié)構(gòu)最常用的方法之一[7-8]，但是由于磁性納米顆粒的表面積與體積之比較大，為了使表面能最小化而傾向于團(tuán)聚[13-14]，使得磁性納米顆粒在流體介質(zhì)中均勻分散是很有難度的，故使用該方法制備小尺寸微柱陣列填充率較低，不便于對細(xì)胞施加均勻力學(xué)刺激；納米線沉積法是Sniadecki N J 在2007 年提出的，該方法可以將磁性微柱的尺寸制備得較小，但制備工藝較為復(fù)雜，嵌入率低，不能夠?qū)崿F(xiàn)全場內(nèi)的均勻驅(qū)動；干性納米顆粒法是比較便捷的一種方法，2012 年，Khademolhosseini F 等將干納米磁性顆粒涂抹在陰模上，使用永磁體將顆粒吸入陰模微洞中，二次鑄模后得到磁性微柱陣列最小直徑為8 μm，高度為18 μm，對于平均大小在幾十納牛的細(xì)胞牽引力來說，所能得到的偏轉(zhuǎn)量小于200 nm，使用一般光學(xué)顯微鏡很難觀測。 所以，如果想要能夠使用磁性微柱陣列對細(xì)胞施加均勻力學(xué)刺激并進(jìn)行測量的話，必須制備小尺寸磁性微柱陣列。

使用單一聚合物成分(如聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS))微柱陣列測量細(xì)胞響應(yīng)時，由于微柱整體透明，微柱陣列頂端在顯微圖像中呈現(xiàn)圓形亮斑狀，經(jīng)過簡單圖像處理后，使用形態(tài)學(xué)方法解算微柱圓心的質(zhì)心坐標(biāo)偏移量即可獲得微柱的位移矢量。 但是磁性微柱陣列不透光，微柱整體在顯微圖像中呈現(xiàn)黑色，故微柱偏移時，頂面圓心坐標(biāo)不容易使用常規(guī)方法提取。

本文針對現(xiàn)有磁性微柱陣列制備工藝的不足，提出了一種使用干性納米顆粒法制備小尺寸磁性微柱陣列的方法，并通過永磁體對其進(jìn)行驅(qū)動，實現(xiàn)了較小磁場下磁性微柱陣列的偏轉(zhuǎn)，針對磁性微柱頂面圓心坐標(biāo)不容易使用常規(guī)方法提取的問題，提出了適用于磁性微柱陣列偏轉(zhuǎn)的圖像處理算法。

1 實驗部分

1.1 磁性微柱陣列修飾比率及剛度研究

使用多物理場仿真軟件COMSOL Multiphysics(COMSOL Inc.，瑞典)建模，研究磁性微柱偏轉(zhuǎn)的可見性以及磁性微柱的剛度。 在此研究中，將磁性部分使用實際相同直徑的200 nm 磁性微球進(jìn)行一定磁場下的偏轉(zhuǎn)仿真，驗證是否能夠滿足一般光學(xué)顯微鏡的成像分辨率，然后對磁性微柱進(jìn)行模擬細(xì)胞力的仿真，得到磁性微柱的剛度。

1.2 小尺寸磁性微柱陣列制備及驅(qū)動

1.2.1 實驗材料及儀器

主要材料及試劑:PDMS 購自美國Dow Corning公司；SU-8 光刻膠購自美國Microchem 公司；1H，1H，2H，2H-全氟辛基-三氯硅烷(以下簡稱硅烷)購自美國Sigma-Aldrich 公司；四氧化三鐵納米顆粒購于中國中科雷鳴公司。

主要儀器設(shè)備:真空干燥箱(DZF-6020，上海一恒科技儀器有限公司，中國)、紫外臭氧清洗機(LXY - PL16，SEN Inc.，日 本)、超 聲 波 清 洗 機(JP-010S，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司，中國)、倒置顯微鏡(Eclipse Ti-U，Nikon Instruments Inc.，美國)、60 倍油浸物鏡(MRD01605，Nikon Instruments Inc.，美國)、環(huán)境掃描電子顯微鏡(以下簡稱電鏡)(Quanta200，F(xiàn)EI Inc.，荷蘭)。

1.2.2 磁性微柱的制備方法

制備小尺寸磁性微柱陣列采用軟光刻技術(shù)[15]，用二次鑄模法制備。 制備磁性微柱的材料是PDMS和粒度為200 nm 的四氧化三鐵顆粒。 為了滿足高倍物鏡焦距短的成像要求，使用二次鑄模工藝制備磁性微柱陣列，得到以蓋玻片為基底且滿足60 倍物鏡成像工作距離的磁性微柱陣列，其工藝流程圖如圖1 所示，為便于理解，對磁性微柱陣列尺寸比例進(jìn)行了夸大處理。

圖1 磁性微柱陣列制備流程

在制備磁性微柱陣列時，首先根據(jù)設(shè)計好的圖案制作光刻掩膜版，對旋涂在硅片上的SU-8 光刻膠通過光刻掩膜版進(jìn)行紫外曝光、顯影[16-17]后，得到直徑為3 μm、高度為9 μm、中心間距為9 μm 的SU-8 光刻膠垂直懸臂梁陣列硅片。 然后對硅片模具進(jìn)行12 h 的硅烷化處理，在微柱表面形成一層硅烷薄膜，以便于一次脫模，延長硅片模具的使用壽命。 處理后，將PDMS 預(yù)聚物與固化劑按照10 ∶1 的比例混合均勻，置于真空干燥箱中抽氣，除去其中的氣泡。 將抽氣后的PDMS 混合物澆鑄在硅模具表面，在110 ℃下固化30 min，脫模后得到PDMS 微洞模具，即陰模。同樣，對陰模也進(jìn)行硅烷化處理，使陰模表面也形成一層硅烷薄膜，避免二次鑄模時PDMS 之間的鍵合，保證后續(xù)脫模成功。 然后，將陰模切割成為所需大小，將干燥的磁性納米顆粒機械性導(dǎo)入陰模，將其放置在釹鐵硼磁鐵上，使顆?？梢赃M(jìn)入微洞中，一段時間后將多余顆粒除去，然后在其表面均勻涂覆約20 μL 的PDMS 混合物，再次置于真空干燥箱中除氣，之后將其倒扣在經(jīng)紫外臭氧清洗機活化了30 min的蓋玻片表面，輕輕按壓陰模，擠出多余的PDMS 混合物。 將其放置在磁場強度約為0.16 T 的釹鐵硼磁鐵中間，50 ℃下磁化3 h，除去磁鐵后，將其再次放入干燥箱中110 ℃固化，18 h 后取出，脫模得到直徑為3 μm 的小尺寸磁性微柱陣列。

使用設(shè)計的結(jié)構(gòu)，將釹鐵硼永磁體使用光學(xué)桿架在顯微鏡載物臺上對磁性微柱陣列進(jìn)行驅(qū)動。 驅(qū)動示意圖如圖2 所示，即驅(qū)動方向與磁化方向正交。

圖2 磁性微柱陣列驅(qū)動示意圖

1.3 磁性微柱陣列圖像識別算法

使用數(shù)學(xué)軟件MATLAB(MathWorks Inc.，美國)對所獲得的一系列磁柱驅(qū)動圖像進(jìn)行基本的灰度變化、濾波、二值化等處理后，利用霍夫變換提取偏移前后頂面圓的圓心坐標(biāo)[18-20]，兩者作差，即可獲得微柱的位移矢量。 算法流程圖如圖3 所示。

圖3 磁性微柱偏移算法流程圖

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性微柱陣列剛度分析

在此研究中，采用在PDMS 微柱中嵌入磁性微球的方式對磁性微柱進(jìn)行仿真分析，仿真所用微球直徑與實際實驗所用直徑相同，為200 nm，對其進(jìn)行固體力學(xué)與無電流磁場仿真，對于正常體積的永磁體來說，磁場大小基本在0.5 T，故在仿真時在x正方向施加0.5 T 的磁場，此時仿真情況為理想情況，即磁場僅在x方向存在，得到0.5 T 磁場下磁性微柱的偏轉(zhuǎn)情況，仿真結(jié)果如圖4 所示。

圖4 內(nèi)嵌多個磁性微球的微柱及磁場驅(qū)動偏轉(zhuǎn)示意圖

由圖4 可以看出，當(dāng)外加磁場的磁場強度為0.5 T時，可以得到136 nm 的偏轉(zhuǎn)量，需要說明的是，由于仿真時受仿真條件限制，所嵌入微球數(shù)量有限，實驗中磁性微球嵌入數(shù)量遠(yuǎn)多于仿真情況，故在實際實驗中所得到的偏轉(zhuǎn)量也更大，所以仿真結(jié)果得到的位移小于實際情況。

微柱除受磁場力作用外，還會受到細(xì)胞對微柱頂端施加的牽引力。 本文還對磁性微柱進(jìn)行了固體力學(xué)仿真，首先在微柱底端增加固定約束，然后對磁性微柱的上表面施加0～80 nN 的力來模擬細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞牽引力，得到磁性微球修飾的微柱的力學(xué)應(yīng)力應(yīng)變曲線，如圖5 所示。 由關(guān)系圖可以看出，磁性微柱偏轉(zhuǎn)的位移均與受力在0～80 nN 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，計算可得，磁性微球修飾的磁性微柱剛度為54.31 nN/μm。細(xì)胞在響應(yīng)外界刺激并發(fā)生收縮、遷移等行為時，能夠拉動微柱的剛度大約為數(shù)十納牛每微米，故對于磁性微柱來說，是可以測量細(xì)胞的響應(yīng)的。

圖5 磁性微球修飾微柱力學(xué)應(yīng)力應(yīng)變曲線

2.2 磁性微柱陣列制備結(jié)果

使用上述方法制備以蓋玻片為基底的磁性微柱陣列，樣品邊長約為5 mm，如圖6(a)所示。 與2007年，Sniadecki N J[11]所提出的使用納米線法制備的磁性微柱相比，方法簡單易操作，并且嵌入率高，能夠得到顯微鏡視場范圍內(nèi)均勻的磁性微柱陣列。

圖6 磁性微柱陣列樣品

在對活細(xì)胞施加力學(xué)刺激并測量其響應(yīng)時，為了能夠清晰地觀測細(xì)胞，通常使用60 倍及以上的高倍物鏡進(jìn)行觀測。 但是顯微鏡的倍數(shù)與工作距離有著天然的制約關(guān)系，物鏡倍數(shù)越高，工作距離越小，故需要將磁性微柱陣列制備得較薄來滿足高倍物鏡成像工作距離的要求。

實驗中使用的60 倍油浸物鏡的工作距離為0.13 mm，觀測時推薦使用0.17 mm 左右厚度的蓋玻片為樣品基底。 對本文加工的薄微柱陣列樣品進(jìn)行60 倍油浸物鏡的顯微觀測，如圖6(b)所示，可以看到成像清晰，對比度良好。 使用掃描電子顯微鏡對磁性微柱陣列進(jìn)行成像，如圖6(c)所示，可以看到磁性微柱直徑約3 μm，中心距為9 μm。 并且，從磁性微柱陣列的掃描電子顯微圖可以看出，利用二次鑄模工藝制備的以蓋玻片為基底的磁性微柱陣列除有部分未拔出外，排列均勻、大小均一。

在磁性微柱陣列制備時，硅烷化的情況對于后續(xù)制備有一定影響，所以硅烷化對于磁性微柱陣列制備來說是十分重要的。 首先需要對硅片進(jìn)行硅烷化，目的是便于一次脫模，并延長硅片模具的使用壽命，然后使用PDMS 制備陰模。 陰模制備完成后也要進(jìn)行硅烷化處理，目的是便于二次鑄模后順利脫模。 但是硅烷化對于硅片和陰模都是有影響的:如果硅片多次硅烷化，會對硅片有一定的損傷；陰模多次硅烷化后，微洞尺寸會逐漸減小，使得微柱尺寸不準(zhǔn)確的同時也不便于二次脫模，降低微柱成品率。硅烷化的時間建議在12 h 以上，這樣能夠使得在硅片或者陰模上能夠形成一層均勻致密的硅烷層。

在磁性微柱陣列制備中，最重要的就是磁性納米顆粒的磁化問題。 對于硬磁材料來說，磁化后的剩磁是使其具有磁性的必要條件，但對于四氧化三鐵這種軟磁性材料來說，磁化后的剩磁會很快流失，所以對于四氧化三鐵來說，磁化過程的主要作用是使磁性納米顆粒存在一定的排布。 在2020 年，Jeon J[10]的文章里提到各種磁性顆粒磁化的排布對于磁性微柱驅(qū)動的影響，當(dāng)驅(qū)動方向與磁性納米顆粒的排布垂直時，微柱偏轉(zhuǎn)的角度最大。

磁性納米顆粒首先在填入陰模后就要進(jìn)行磁化，使其能夠進(jìn)入陰模；其次，在二次鑄模完成后，就要再次進(jìn)行磁化，目的是為了使得磁性納米顆粒能夠在PDMS 中形成與磁化磁場方向一致的排布。 便于后續(xù)使用與磁化磁場方向正交的磁場進(jìn)行驅(qū)動。磁化過程中，溫度不宜過高，要保證PDMS 處于流動狀態(tài)。 較低的溫度可以降低PDMS 的收縮速度，防止PDMS 中滯留氣泡的膨脹，使得PDMS 能夠完全包裹磁性顆粒。

2.3 磁性微柱陣列驅(qū)動及偏轉(zhuǎn)識別

使用磁場強度約為0.32 T 的永磁體對磁性微柱陣列進(jìn)行驅(qū)動，驅(qū)動后如圖7(a)所示。 對圖像進(jìn)行二值化，能明顯看到微柱整個呈現(xiàn)橢圓狀，如圖7(b)所示。 在截取區(qū)域原圖像上標(biāo)明圓心坐標(biāo)，如圖7(c)所示。 由于驅(qū)動時永磁體磁場方向為右上，能夠看到磁性微柱隨著永磁體的靠近，即磁場增強的情況下，偏轉(zhuǎn)量逐漸增大，偏移情況如圖7(d)所示。 其中箭頭表示位移偏移矢量，箭頭長短代表的位移偏轉(zhuǎn)量的大小，箭頭方向代表偏轉(zhuǎn)的方向，最大偏移量為0.589 μm。

圖7 磁性微柱算法處理圖

磁性微柱的驅(qū)動方式有很多，最便捷的方式是使用永磁體，這也是大多數(shù)論文中所提到的驅(qū)動方法。 如Khademolhosseini F[3]等使用飛輪和連桿將電機軸的旋轉(zhuǎn)運動轉(zhuǎn)化為軌道導(dǎo)軌上磁鐵座的正弦往復(fù)運動，插入磁鐵座的永磁體對盤片底部的遷移芯片施加磁場；Jeon J[10]等使用電動位移臺來控制兩個圓形永磁體之間的距離，對磁性微柱進(jìn)行驅(qū)動。本文采用自行設(shè)計的結(jié)構(gòu)夾持永磁體，通過光學(xué)桿連接在光學(xué)平臺，調(diào)節(jié)光學(xué)桿的位置使永磁體靠近磁性微柱陣列，進(jìn)行驅(qū)動。

使用永磁鐵驅(qū)動磁性微柱的研究中，通常使用的磁場強度在0～0.6 T，與2007 年Sniadecki N J 所使用0.31 T[11]、2012 年Khademolhosseini F 所 使 用 的0～0.35 T[8]以及2020 年Jeon J 組所使用的0.05 T ～0.6 T[10]的磁場強度相近，對于小尺寸磁性微柱陣列來說，測量牽引力和施加力學(xué)刺激的空間分辨率更高，更利于細(xì)胞鋪展和生長。 其次，磁性微柱尺寸小，驅(qū)動時所需磁場小，所需永磁體體積也小，從而可控性好，進(jìn)而實驗測量時環(huán)境更穩(wěn)定、安全。 本文使用干性納米顆粒法所制備的磁性微柱直徑為3 μm，且磁性顆粒分布較勻，所需磁場在0.32 T 左右。 在實驗中若使用磁場大的永磁體，磁力很強，實驗時候需要特殊的夾持裝置來控制永磁體，并且容易對顯微鏡上的鐵磁性材料產(chǎn)生影響，影響實驗效果。

與普通PDMS 微柱圖像處理相比，磁性微柱陣列與基底對比度高，微柱頂面的成像質(zhì)量較好，但由于側(cè)壁和頂面均呈現(xiàn)黑色，在微柱發(fā)生偏轉(zhuǎn)時呈橢圓形，本文提出采用霍夫變換提取圓心的方法對磁性微柱頂端偏轉(zhuǎn)進(jìn)行識別，可以實現(xiàn)在同一張顯微照片上分別識別微柱頂、底面的圓心，進(jìn)而便于計算微柱的偏移。

當(dāng)微柱偏移量較大時，會識別出多個圓。 對于霍夫變換識別多個圓的情況，首先可以通過調(diào)節(jié)霍夫變換參數(shù)，即半徑步長、角度步長、半徑最大值、半徑最小值和閾值來使算法只識別微柱底面和頂面的兩個圓。 其次，根據(jù)實際情況(如驅(qū)動方向)，若識別到的圓與驅(qū)動方向相反，則直接剔除；若偏轉(zhuǎn)方向與驅(qū)動方向一致，則保留偏轉(zhuǎn)量最大的圓。

3 結(jié)論

提出了一種使用干性納米顆粒，采用二次鑄模法制備，能夠滿足高倍鏡成像的以蓋玻片為基底的，小尺寸磁性微柱陣列的制備方法，制備了直徑為3 μm、以蓋玻片為基底的磁性微柱陣列。 通過仿真研究了在模擬不同細(xì)胞力的情況下磁性微柱的偏轉(zhuǎn)情況，得到其剛度為54.31 nN/μm。 實驗使用永磁體對磁性微柱陣列進(jìn)行驅(qū)動，采用霍夫變換解決了磁性微柱陣列不透光，微柱整體在顯微圖像中呈現(xiàn)黑色，偏移時頂面圓心坐標(biāo)不容易使用常規(guī)方法提取的問題，對磁性微柱陣列的偏轉(zhuǎn)進(jìn)行識別，得到了較小磁場下的微柱偏移量。 為對細(xì)胞在體外施加力學(xué)刺激并進(jìn)行原位測量提供了新的思路。