王海霞，沈明霞，謝海彬，趙鯤鵬，李雪燕，張旭輝，張帆，馬玉坤，李紅，*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

肺間質(zhì)纖維化(Pulmonary fibrosis，PIF)是一種慢性、進(jìn)行性、不可逆性肺部疾病[1]，發(fā)病率[2]及死亡率[3]逐年增高，且發(fā)病機(jī)制不明，西醫(yī)缺乏有效治療手段[4-5]，目前中醫(yī)藥治療成為研究熱點(diǎn)，但是單純的證候動物模型或疾病動物模型已不能滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)探索證候診斷標(biāo)準(zhǔn)和演變規(guī)律的需要，多因素復(fù)合模型憑借其分別或同時(shí)采用中醫(yī)學(xué)病因復(fù)制證候模型和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因復(fù)制疾病動物模型，能同時(shí)表現(xiàn)出疾病和證候特征的優(yōu)勢而逐漸被應(yīng)用，因此，證候動物模型制作的合理性決定了證候?qū)嶒?yàn)研究的成敗。本實(shí)驗(yàn)以PIF的主要證候氣虛血瘀證為切入點(diǎn)，采用力竭游泳+高脂飲食+氣管內(nèi)推注博來霉素法建立氣虛血瘀型PIF大鼠模型，完善該模型的評價(jià)體系，以便遣方用藥，提高臨床療效。

肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)能夠促進(jìn)受損組織重建，抑制纖維化發(fā)生，結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor，CTGF)作為肺纖維化的標(biāo)志，可介導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)PIF的進(jìn)展。通過觀察HGF及CTGF在氣虛血瘀型PIF大鼠病程中動態(tài)表達(dá)及兩者之間的變化趨勢，了解促纖維化與抗纖之間的關(guān)系，為后期防治纖維化及延緩疾病進(jìn)程提供治療方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±10)g，許可證號：SCXK(甘)2015-0002。實(shí)驗(yàn)前動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 試劑及實(shí)驗(yàn)器材

注射用鹽酸博來霉素(海正輝瑞制藥有限公司，批號：17121941)；中/長鏈脂肪乳注射液(C8-24Ve)(西安立邦制藥有限公司，批號：H20055883)；4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司，批號：P1110)；熒光定量試劑盒Go Taq?qPCR Master Mix(Promega，批號：A6001)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，批號：K1622)，引物由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)；HGF ELISA試劑盒(Jiangsu Fiya Biological Technology Co,Ltd，批號：MM-0152R1)；CTGF ELISA試劑盒(Jiangsu Fiya Biological Technology Co,Ltd，批號：MM-0084R1)；石蠟切片機(jī)(德國，RM2135)；石蠟包埋機(jī)(日本，TEC-VEM-J2)；石蠟脫水機(jī)(日本，VIP-5JR-J2)；倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司，IX81)；B2級生物安全柜(HF safe-1200 B2，上海)；紫外可見分光光度計(jì)(Thermo BioMate 3S，美國)；PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad icycle IQ，美國)；熒光定量PCR儀(FTC-3000P，加拿大)。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開始力竭游泳+高脂飲食法證候造模。

力竭游泳法[6-7]：先進(jìn)行1周的適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，隔日1次，每次2 min，之后進(jìn)行力竭游泳，水溫37℃，水深35 cm，鼠尾根部按體重的5%負(fù)重。力竭標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)沉入水中3次且每次>5 s，游泳隔日1次。

高脂飲食[8-9]：脂肪乳按10 mL/(kg·d)灌胃1次。于造模第10天、20天、30天分別進(jìn)行氣虛血瘀證候評分[10]。評分達(dá)到成功標(biāo)準(zhǔn)者，為證候造模成功大鼠。

選取證候造模成功大鼠，采用氣管內(nèi)推注博來霉素法建立氣虛血瘀型PIF大鼠模型。大鼠用10%的水合氯醛(1 mL/100g)腹腔麻醉后，仰臥位固定于操作臺，備皮、消毒、暴露氣管，用1 mL注射器抽取博來霉素溶液(用0.9% Nacl溶液將博來霉素配制成5 mg/mL)，以氣管軟骨環(huán)間隙為定位朝向心端刺入氣管，有落空感后注射器微微上翹使針頭平行進(jìn)入，迅速將藥液注入氣管，給藥量為5.0 mg/kg[11-12]，然后拔出針管將大鼠頭高腳低位均速并連續(xù)旋轉(zhuǎn)1 min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺中，完成后縫合切口，常規(guī)消毒，給予紅霉素軟膏涂抹傷口以預(yù)防感染?？瞻捉M大鼠按同樣方法氣管內(nèi)推注等體積生理鹽水。待動物自然清醒后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.2 氣虛血瘀證癥狀量化評分表

結(jié)合2002年出版《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》中的血瘀證部分和氣虛證部分的癥狀分級量化評分表及實(shí)驗(yàn)中觀察所得設(shè)計(jì)出“大鼠氣虛血瘀證癥狀量化評分表”[13]。具體見表1。

表1 氣虛血瘀型大鼠癥狀量化評分表

注：總分共計(jì)15分，其中氣虛血瘀證Ⅰ度：2～5分；氣虛血瘀證Ⅱ度：5～9分；氣虛血瘀證Ⅲ度：9～13分，氣虛血瘀證Ⅳ度：13～15分。

1.3.3 大鼠游泳時(shí)間測定

每天灌胃1 h后，除空白組外，測定其余大鼠強(qiáng)迫游泳至疲勞狀態(tài)的時(shí)間(即大鼠從入水到力竭為止)。

1.3.4 一般情況觀察及指標(biāo)檢測

參照表1進(jìn)行觀察，并記錄體質(zhì)量、進(jìn)食量。將造模后第7天、14天、28天大鼠分批處死。麻醉后心臟采血5 mL，頸椎脫臼法處死，沿胸腔兩側(cè)剪斷肋骨，暴露心肺，完整分離出氣管和雙肺并去除周圍結(jié)締組織，預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，取右下肺固定于4%多聚甲醛中，進(jìn)行HE、Masson染色。

1.3.5 肺組織病理損傷、纖維化判斷

染色后，在顯微鏡下觀察肺組織HE、Masson情況并根據(jù)Szapiel[14]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，具體見表2和表3。

1.3.6 ELISA法檢測血清中HGF及CTGF的表達(dá)

心臟取血并以4℃，3 500 r/min離心10 min，收集血清,-80℃存儲,用于血清HGF、CTGF測定，檢測方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

表3 Masson染色后肺組織纖維化評分

1.3.7 熒光定量PCR檢測肺組織HGF、CTGF mRNA表達(dá)

取肺組織100 mg，按Trizol法提取總RNA；用紫外

可見分光光度計(jì)測定總RNA濃度及純度后，cDNA合成利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，操作方法步驟參照說明書進(jìn)行。按照熒光定量試劑盒Go Taq?qPCR Master Mix配制反應(yīng)體系后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。

反應(yīng)體系：Nuclease-Free Water(7.2 μL)；上下游引物10 μM(0.4 μL)；Go Taq?qPCR Master Mix2×(10 μL)；cDNA(2 μL)。

反應(yīng)體系：95℃預(yù)變性2 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)最后采用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。上下游引物序列，見表4。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測量采用重復(fù)測量計(jì)量資料方差分析，以P≤0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氣虛血瘀模型評價(jià)要素

2.1.1 氣虛血瘀模型大鼠表征

采用力竭游泳+高脂飲食法造模后，大鼠活動量減少，反應(yīng)遲鈍，出現(xiàn)各種程度的精神萎靡、喜扎堆蜷臥，被毛枯槁、脫落，大便量明顯增多，糞質(zhì)稀軟，不同部位(如口唇、齒齦、爪甲、耳緣)可出現(xiàn)不同程度的脈絡(luò)瘀阻。而空白組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，反應(yīng)靈敏，被毛始終潤滑有光澤，大便正常，各部位極少出現(xiàn)血瘀等情況。見圖1。

注：A：未力竭狀態(tài)；B：力竭狀態(tài)；C：空白組-舌體；D：模型組-舌體；E：空白組-舌底；F：模型組-舌底；G：空白組-唇周；H：模型組-唇周；I：空白組-耳緣；J：模型組-耳緣；K：空白組-大便；L：模型組-大便。圖1 氣虛血瘀模型大鼠表征圖片

2.1.2 力竭游泳時(shí)間

大鼠力竭游泳時(shí)間先上升到達(dá)一定程度后又逐漸下降，總體呈逐漸下降趨勢，末次游泳時(shí)間低于初次游泳時(shí)間，說明負(fù)重游泳后逐漸出現(xiàn)疲乏無力，最終呈現(xiàn)氣虛狀態(tài)。見表5、圖2。

表5 大鼠游泳時(shí)間

注：時(shí)間因素主效應(yīng)，F(xiàn)=7.961，P<0.01；與第1天比較,aP<0.01，bP<0.05；與第3天比較,cP<0.01，dP<0.05；與第5天比較,eP<0.01，fP<0.05；與第7天比較,gP<0.01，hP<0.05；與第9天比較,iP<0.01，mP<0.05；與第11天比較,nP<0.01；與第13天比較,lP<0.01。

2.1.3 體質(zhì)量比較

動態(tài)觀察大鼠的生長狀況，結(jié)果空白組與氣虛血瘀模型組大鼠體質(zhì)量均較前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；氣虛血瘀模型組大鼠體質(zhì)量較空白組增長較慢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；時(shí)間和分組對體質(zhì)量的變化有交互作用(P<0.05)。見表6、圖3。

2.2 氣虛血瘀模型大鼠癥狀量化評分

氣虛血瘀模型大鼠造模各時(shí)間段均出現(xiàn)不同程度的氣虛血瘀癥狀，且程度隨造模時(shí)間延長而逐漸加重，較空白組差異顯著(P<0.01)，其中第10天氣虛血瘀評分為Ⅰ度；第20天評分為Ⅱ度；第30天評分為Ⅲ度。見表7。

表6 兩組大鼠體質(zhì)量比較

注：處理因素主效應(yīng)，F(xiàn)=1.242，P>0.05；時(shí)間因素主效應(yīng)F=116.234，P<0.01；兩者有交互作用，F(xiàn)=9.534，P<0.05；與造模前比較,aP<0.01；與造模1周比較,bP<0.01；與造模2周比較,cP<0.01；與造模3周比較,dP<0.01。

圖3 大鼠體質(zhì)重方差輪廓圖

組別n第10天第20天第30天空白組150.60±0.520.50±0.530.70±0.48氣虛血瘀模型組614.90±0.61a7.65±0.71a9.65±0.53at-16.939-25.592-39.481P<0.01<0.01<0.01

注:與空白組比較,aP<0.01。

2.3 氣虛血瘀PIF模型大鼠肺系數(shù)

與對照組比較，同期氣虛血瘀PIF模型組肺系數(shù)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。結(jié)果見表8。

肺系數(shù)(%)=肺重(mg)/體重(g)×100%

表8 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)氣虛血瘀型PIF大鼠肺系數(shù)比較

2.4 HE、Masson染色及評分

觀察肺組織HE染色發(fā)現(xiàn)，對照組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，支氣管黏膜上皮及肺泡無變形，無細(xì)胞脫落，無炎性細(xì)胞滲出、聚集；氣虛血瘀PIF模型組7天：肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔塌陷，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增寬；14天：肺泡炎性細(xì)胞較前減少，肺泡壁明顯增厚，間隔增寬，成纖維細(xì)胞增生，逐漸出現(xiàn)纖維組織；28天：炎性細(xì)胞浸潤逐漸消失，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間隔斷裂，伴隨大量成纖維細(xì)胞及膠原沉積。見圖4。

觀察肺組織Masson染色發(fā)現(xiàn)，對照組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織支氣管壁膠原層較薄，肺泡區(qū)有較少呈淺藍(lán)色的膠原纖維；氣虛血瘀PIF模型組7天：肺泡間隔增寬并出現(xiàn)藍(lán)色的膠原纖維，而在支氣管壁以及血管壁上亦可見到藍(lán)色的膠原纖維；14天：大量纖維增生，藍(lán)色膠原纖維出現(xiàn)于支氣管、血管外壁及增厚的肺泡隔內(nèi)；28天：彌漫性肺纖維化形成，各區(qū)域均可見大量藍(lán)色膠原纖維增生出現(xiàn)。見圖5。

注：A：對照組7天；B：對照組14天；C：對照組28天；D：氣虛血瘀PIF模型組7天；E：氣虛血瘀PIF模型組14天；F：氣虛血瘀PIF模型組28天。圖4 大鼠肺組織HE染色(200×)

注：A：對照組7天；B：對照組14天；C：對照組28天；D：氣虛血瘀PIF模型組7天；E：氣虛血瘀PIF模型組14天；F：氣虛血瘀PIF模型組28天。圖5 大鼠肺組織Masson染色(200×)

肺組織病理損傷及肺纖維化評分較同期對照組均明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表9。

2.5 ELISA法檢測血清中HGF及CTGF的表達(dá)

與對照組比較，同期氣虛血瘀PIF模型組大鼠血清HGF表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且與纖維化程度成正比，其中氣虛血瘀PIF模型28天與模型7天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，同期氣虛血瘀PIF模型組大鼠血清CTGF表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，且與肺纖維化程度成正比。見表10、圖6～7。

表9 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織病理學(xué)評分比較

表10 各組大鼠血清中HGF、CTGF的含量比較

圖6 血清中HGF的含量

圖7 血清中CTGF的含量

2.6 肺組織中HGF及CTGF的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示：與對照組比較，同期氣虛血瘀PIF模型組大鼠肺組織HGF相對表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中氣虛血瘀PIF模型28天與模型7天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，同期氣虛血瘀PIF模型組大鼠肺組織CTGF相對表達(dá)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，且與肺纖維化程度成正比。見表11,圖8～9。

表11 各組大鼠肺組織中HGF、CTGF的相對表達(dá)量

圖8 肺組織HGF的相對表達(dá)量

圖9 肺組織CTGF的相對表達(dá)量

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以氣血理論為基礎(chǔ)，采用力竭游泳+脂肪乳灌胃的方法建立氣虛血瘀型大鼠模型，在此基礎(chǔ)上采用單劑量氣管內(nèi)推注博來霉素法使之發(fā)生纖維化，最終建立氣虛血瘀型肺間質(zhì)纖維化模型大鼠。并在造模后觀察肺系數(shù)、肺組織病理學(xué)HE、Masson染色來綜合評定模型是否成功。結(jié)果,氣虛血瘀PIF模型大鼠肺系數(shù)較空白組增高，但隨著纖維化程度的加重而逐漸降低，反應(yīng)了纖維化疾病的發(fā)展規(guī)律；肺組織病理學(xué)變化是判斷造模是否成功的重要指標(biāo)，HE染色可以將正常組織或病變組織的細(xì)胞成分的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)顯示出來[15]，而Masson染色可以反映組織中的纖維化程度，兩者結(jié)合可以直接反映肺纖維化的病理改變[16]。從染色結(jié)果來看,氣虛血瘀PIF模型組大鼠第7天炎癥反應(yīng)明顯，而14天后纖維化逐漸加重。綜上，本次模型建立十分成功。

HGF、CTGF是纖維化病程中的兩個(gè)重要因子，具有相互拮抗又對立統(tǒng)一的關(guān)系。兩者結(jié)合點(diǎn)在TGF-β1，其中HGF能抑制纖維化發(fā)展，而CTGF則能促進(jìn)纖維化的發(fā)展，正常情況下兩者處于動態(tài)平衡狀態(tài)。HGF通過抑制肌成纖維細(xì)胞中TGF-β1的產(chǎn)生來促進(jìn)其凋亡的發(fā)生減輕肺纖維化，同時(shí)CTGF作為TGF-β1特異性下游介質(zhì)，可與TGF-β1相互作用誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為肌成纖維細(xì)胞，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使ECM沉積，最終導(dǎo)致肺纖維化。

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在正常大鼠中HGF與CTGF均有表達(dá)，但兩者表達(dá)處于平衡狀態(tài)，故未發(fā)生肺纖維化，在氣虛血瘀型PIF模型組大鼠中，HGF表達(dá)降低，CTGF表達(dá)增高，兩者動態(tài)平衡被破壞，發(fā)生肺纖維化，且隨著病程進(jìn)展，CTGF表達(dá)逐漸上升，而HGF則逐漸下降，偏離平衡狀態(tài)愈來愈遠(yuǎn)，病情則越發(fā)加重。

反向思考，以本實(shí)驗(yàn)中氣虛血瘀模型為基點(diǎn)，使用益氣活血類中藥，以TGF-β1為切入點(diǎn)，發(fā)揮HGF的正向作用進(jìn)而抑制肌成纖維細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，或者削弱CTGF的促纖維化作用。若使兩者重新回歸平衡狀態(tài)，能否延緩或者控制纖維化病情的發(fā)展？即陰平陽秘，精神乃治。