徐衛(wèi)東, 顧 曉

(1. 揚(yáng)州大學(xué), 江蘇 揚(yáng)州, 225000; 2.南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院, 江蘇 儀征, 2214003. 揚(yáng)州大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

膀胱癌是全球范圍內(nèi)泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1-4]。膀胱癌早期癥狀不明顯，且早期的診斷技術(shù)特異性和靈敏性欠佳，患者診斷膀胱癌時(shí)多已是中晚期[5-8]。目前，膀胱癌的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率還是較高，加強(qiáng)膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及其分子機(jī)制研究，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)以及后期個(gè)體化治療有著深遠(yuǎn)的意義[9-13]。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMTs)在蛋白質(zhì)的甲基化中起著十分重要的作用[14-16]。PRMTs在真菌、高等植物以及無(wú)脊椎和脊椎動(dòng)物中都有著廣泛的表達(dá)，能夠?qū)-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移到底物蛋白胍基上，從而影響RNA轉(zhuǎn)錄、RNA剪接、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[17-20]?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的PRMTs家族成員有11個(gè)，根據(jù)催化精氨酸甲基化方式的不同，可將其主要分為以下3種類型[21]: ① Ⅰ型PRMT家族成員，包括PRMT 1～4、PRMT6、PRMT8, 其可以催化形成單甲基精氨酸(MMA)和非對(duì)稱二甲基精氨酸(ADMA); ② Ⅱ型PRMT家族成員，包括PRMT5、PRMT9, 可以催化形成MMA 和對(duì)稱性二甲基精氨酸(SDMA); ③ PRMT7是唯一的Ⅲ型PRMT, 只能催化形成MMA。PRMT5是一種非常重要的II型PRMT, 在所有研究的真核生物中都發(fā)現(xiàn)了它的存在，其作為一種表觀遺傳酶，能夠?qū)ΨQ性地甲基化組蛋白或者非組蛋白底物的精氨酸殘基，影響靶基因的表達(dá)或者信號(hào)分子的翻譯后修飾，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，發(fā)揮著不同生物學(xué)功能[17-18, 22-23]。大量研究[24-30]表明, PRMT5在多種腫瘤中顯著高表達(dá)，如在乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、惡性膠質(zhì)瘤、卵巢癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌以及白血病等疾病中表達(dá)水平都較正常人群增高，發(fā)揮著癌基因作用。

大量證據(jù)表明PRMT5可能是臨床腫瘤篩查的重要標(biāo)志物。本研究檢測(cè)PRMT5在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)情況，探討其在膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的意義。通過(guò)癌癥基因組圖譜(TCGA)公共數(shù)據(jù)集，在RNA水平研究PRMT5在膀胱癌及正常組織中的表達(dá)水平及其對(duì)預(yù)后生存的影響，在此基礎(chǔ)上再通過(guò)組織芯片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，在蛋白水平驗(yàn)證上述結(jié)果，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 癌癥和腫瘤基因圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)

TCGA是美國(guó)政府2005年發(fā)起資助的癌癥研究項(xiàng)目，是目前最大的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)，目前主要由美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(NCI)和國(guó)家人類基因組研究所(NHGRI)共同維護(hù)。TCGA通過(guò)大規(guī)模的高通量的基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析，系統(tǒng)地匯總并揭示疾病的遺傳突變信息，了解癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，為疾病的預(yù)防、診斷以及治療提供了理論基礎(chǔ)，最后勾畫出新型“預(yù)防癌癥的策略”。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的每個(gè)樣本包含多種基因組學(xué)信息，有基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)、基因分型數(shù)據(jù)、全基因組DNA甲基化表達(dá)數(shù)據(jù)以及microRNA表達(dá)數(shù)據(jù)等。本研究下載了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的349例膀胱癌患者的基因表達(dá)譜及相關(guān)的臨床信息進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣本

1.2.1 樣本收集: 收集2007-2011年南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院以及江蘇省中醫(yī)院接受手術(shù)治療的56例膀胱癌病例，在簽署知情同意書(shū)后，采集其癌組織和癌旁組織。所有患者術(shù)前未接受化療，有完整的臨床資料及術(shù)后回訪資料。所有標(biāo)本均在手術(shù)切除后10 min內(nèi)收集, 4%中性福爾馬林固定，經(jīng)石蠟包埋和組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。所有病例是組織病理學(xué)確診的膀胱癌患者。

1.2.2 流行病學(xué)調(diào)查: 對(duì)調(diào)查人員進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)，并且設(shè)計(jì)好統(tǒng)一的調(diào)查表，然后采用面對(duì)面的方式調(diào)查研究對(duì)象。調(diào)查內(nèi)容主要包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、臨床分期、病理分級(jí)、腫瘤大小以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。自2014年3月對(duì)調(diào)查對(duì)象進(jìn)行跟蹤隨訪。所有結(jié)果使用EpiData 3.1進(jìn)行雙軌錄入，并進(jìn)行邏輯校對(duì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織芯片: 將HE染色切片進(jìn)行病理診斷，并對(duì)病變組織的范圍進(jìn)行標(biāo)記; 按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)組織芯片陣列的組織類型和排列方式; 在組織數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇合適的組織病例編號(hào); 按照組織病例編號(hào)從組織庫(kù)中取出組織蠟塊和對(duì)應(yīng)的HE染色切片; 用組織包埋機(jī)制備合適的空白受體蠟塊; 用組織陣列儀按照陣列設(shè)計(jì)抽提病理蠟塊組織芯，并有規(guī)律的排列在空白受體蠟塊上; 組織陣列塊在52 ℃恒溫烤箱中加熱融合，使組織芯與受體蠟塊緊密相連; 用全自動(dòng)組織切片機(jī)以20 μm/轉(zhuǎn)的進(jìn)刀速度對(duì)組織陣列塊進(jìn)行修整蠟塊，直至80%的組織芯完全曝露; 用全自動(dòng)組織切片機(jī)以4 μm/轉(zhuǎn)的進(jìn)刀速度對(duì)組織陣列塊進(jìn)行切片，切片附在防脫片處理的進(jìn)口載玻片上; 陣列切片置于60 ℃恒溫烤箱中，烤片16 h; 組織芯片按編號(hào)每隔10張抽取1張做HE染色; 病理醫(yī)生對(duì)抽檢組織芯片中每一個(gè)組織樣本進(jìn)行復(fù)診質(zhì)檢，結(jié)果輸入組織芯片數(shù)據(jù)庫(kù); 組織芯片實(shí)驗(yàn)白片保存在切片盒中，置于冰箱5 ℃冷藏室保存; 對(duì)使用過(guò)的病理組織蠟塊進(jìn)行封蠟，并將其和對(duì)應(yīng)的HE染色切片歸位放回蠟塊柜和切片盒。作者制作1張組織芯片，共包含了56例膀胱癌組織(黑點(diǎn))和10例癌旁組織(白點(diǎn))。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)組織樣本，每組組織樣本含有完整的臨床病理資料。見(jiàn)圖1。

1.3.2 免疫組化: 將制作好的組織芯片放入烘箱中，溫度調(diào)至63 ℃, 烘蠟1 h。烘蠟過(guò)程中配置好試劑，即10倍濃縮PBS緩沖液和抗原修復(fù)液(pH值=5.96)。片子烘烤完成后，從烘箱內(nèi)取出，放入全自動(dòng)染色機(jī)中，進(jìn)行脫蠟。脫蠟過(guò)程有3個(gè)步驟: 首先二甲苯2缸，每缸15 min; 然后無(wú)水乙醇2缸，每缸7 min; 90%酒精1缸, 5 min; 80%酒精1缸, 5 min; 70%酒精1缸, 5 min。從染色機(jī)中取出片子，用純水沖洗3次, 1 min/次。沖洗過(guò)程中將檸檬酸修復(fù)液放在電磁爐上開(kāi)始加熱。檸檬酸高壓修復(fù): 檸檬酸修復(fù)液沸騰后，將片子放入高壓鍋中，蓋上高壓鍋蓋，待出氣后開(kāi)始計(jì)時(shí)(長(zhǎng)出氣)。計(jì)時(shí)2 min, 到時(shí)間后終止加熱，將高壓鍋蓋打開(kāi)，將其放在水池中冷卻30 min。配制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑。將片子放入阻斷劑中15 min。取出片子，用PBS緩沖液沖洗3次, 1 min/次。冰箱中取出PRMT5一抗，放入離心機(jī)以7 200轉(zhuǎn)離心30 s; 在滴加一抗之前，用免疫組化筆畫出所要滴加一抗的組織范圍，保持濕盒水平放置，滴加動(dòng)物非免疫血清，室溫孵育10 min。取出一抗，按照稀釋度1∶50用DAKO抗體稀釋液稀釋。保持濕盒水平放置，滴加一抗，放入冰箱4度過(guò)夜。第2天，從冰箱取出濕盒，保持濕盒水平放置，室內(nèi)放置30～45 min, 讓濕盒恢復(fù)到室溫狀態(tài)。將片子用PBS緩沖液沖洗3次, 1 min/次。滴加DAKO公司的EnVisionTM+/HRP兔工作液，孵育30 min。到時(shí)間后用PBS沖洗3次, 1 min/次。從冰箱里取出DAB試劑盒，按1 mL DAB稀釋液+1滴DAB色原進(jìn)行配制。在片子上滴加稀釋后的DAB(滴加之前最好在濕盒下面鋪好白色的紙張，以便于看清顯色情況)，顯色5 min(按照實(shí)際情況，染色不再加深可即可停止顯色)，到時(shí)間后自來(lái)水沖洗5 min。片子浸泡在哈氏蘇木素1 min, 到時(shí)間后在0.25%的鹽酸酒精中浸沒(méi)3～4 s, 用自來(lái)水沖洗2 min。將片子放入65 ℃烘箱或者通風(fēng)櫥自然晾干，直至片子沒(méi)有水分，用中性樹(shù)膠封片。

1.3.3 結(jié)果判定: 將使用膀胱癌組織芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的所有PRMT5抗體的原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)納入本次統(tǒng)計(jì)分析。原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的判讀方式: 判讀PRMT5的胞漿、胞核染色的染色強(qiáng)度(0、+、、)和染色陽(yáng)性率，癌組織和癌旁組織(上皮)分別判讀。原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化方案: ① 染色強(qiáng)度評(píng)分: 0分(陰性), 1分(+), 2分(), 3分()。② 染色陽(yáng)性率評(píng)分: 0分(陰性), 1分(1%～25%), 2分(>25%～50%), 3分(>50%～75%), 4分(>75%～100%)。③ 總評(píng)分: 以"染色強(qiáng)度評(píng)分"和"染色陽(yáng)性率評(píng)分"的乘積為總評(píng)分。④ 生存期分析分組: 總評(píng)分≤4為低表達(dá)組，總評(píng)分>4為高表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

配對(duì)t檢驗(yàn)用于比較19對(duì)膀胱癌患者癌組織及癌旁組織中PRMT5基因表達(dá)差異。將PRMT5基因表達(dá)按中位數(shù)分成高、低表達(dá)組，采用Kaplan-Meier方法分析并繪制生存曲線，以及Log-rank方法比較膀胱癌患者PRMT5高、低表達(dá)組的生存情況。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較PRMT5基因表達(dá)高、低組間的性別、TNM分期以及有無(wú)復(fù)發(fā)等臨床特征差異。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SAS統(tǒng)計(jì)軟件 (v.9.2; SAS Institute, Cary, NC)。

2 結(jié) 果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果

2.1.1 PRMT5在配對(duì)的膀胱癌癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異: 下載了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的膀胱癌患者的基因表達(dá)譜，其中匹配的癌和癌旁組織一共有19對(duì)。通過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn)比較這19對(duì)膀胱癌患者癌組織及癌旁組織中PRMT5基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示PRMT5在膀胱癌組織中的表達(dá)水平顯著高于在癌旁組織中的表達(dá)水平(P=0.0001)。見(jiàn)圖2。

2.1.2 PRMT5基因表達(dá)與膀胱癌患者生存的關(guān)聯(lián)性: 本研究下載了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中349例膀胱癌患者的基因表達(dá)譜及預(yù)后信息，并探討PRMT5表達(dá)水平與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系。將PRMT5的表達(dá)量從低到高進(jìn)行排序，取表達(dá)量中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，分為PRMT5低表達(dá)組和PRMT5高表達(dá)組。采用Kaplan-Meier方法分析并繪制生存曲線，接著通過(guò)Log-rank方法比較膀胱癌患者在PRMT5高低表達(dá)組中的生存情況。結(jié)果顯示PRMT5高表達(dá)組的膀胱癌患者較低表達(dá)組膀胱癌患者的預(yù)后更差(Log-rankP=2.6×10-4)。見(jiàn)圖3。

2.1.3 PRMT5基因表達(dá)與膀胱癌患者的臨床特征的相關(guān)性:作者整理了349例膀胱癌患者的相關(guān)臨床信息，包括年齡、臨床分期、病理分級(jí)、腫瘤大小以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，探討PRMT5表達(dá)水平與膀胱癌的關(guān)系。將PRMT5的表達(dá)量按中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較PRMT5基因表達(dá)高、低組的性別、TNM分期以及有無(wú)復(fù)發(fā)等臨床特征差異。結(jié)果顯示PRMT5高表達(dá)更傾向于分布在浸潤(rùn)深度T3、T4(P=0.047), TNM分期T3、T4期(P=0.017)和新發(fā)腫瘤組中(P=0.007)。見(jiàn)表1。

表1 膀胱癌患者PRMT5基因表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性

2.2 組織芯片結(jié)果

2.2.1 PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結(jié)果: 采用組織芯片-免疫組化技術(shù)檢測(cè)PRMT5在膀胱癌和癌旁組中的表達(dá)水平，46例膀胱癌組織和10例癌旁組織的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2、3、4、5、6、7、8。結(jié)果包括PRMT5在每個(gè)樣本胞漿和胞核中的染色強(qiáng)度和染色陽(yáng)性率。

2.2.2 PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的表達(dá): 按結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，將染色強(qiáng)度和染色陽(yáng)性率轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的評(píng)分，然后以“染色強(qiáng)度評(píng)分”和“染色陽(yáng)性率評(píng)分”的乘積為總評(píng)分來(lái)定量表達(dá)PRMT5在膀胱癌和癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用成組t檢驗(yàn)比較2組間PRMT5的表達(dá)水平，結(jié)果無(wú)顯著差異(P=0.563)。接著分別觀察PRMT5在2組細(xì)胞胞核和細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平，結(jié)果也無(wú)顯著差異(P=0.404、0.925)。見(jiàn)圖4。

2.2.3 PRMT5蛋白表達(dá)與膀胱癌癌患者生存時(shí)間的關(guān)系: 將PRMT5蛋白表達(dá)量的總評(píng)分從低到高進(jìn)行排序?？傇u(píng)分≤4為PRMT5低表達(dá)組，總評(píng)分>4為PRMT5高表達(dá)組。采用Kaplan-Meier方法分析并繪制生存曲線，接著通過(guò)Log-rank法比較膀胱癌患者在PRMT5高、低表達(dá)組中的生存情況。結(jié)果顯示2組膀胱癌患者的生存時(shí)間無(wú)顯著差異(Log-rankP=0.285)。分別在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中探討PRMT5的表達(dá)水平與膀胱癌患者生存時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果也無(wú)顯著差異(Log-rankP=0.723、0.298)。見(jiàn)圖5。

表2 A行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結(jié)果

表3 B行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結(jié)果

表4 C行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結(jié)果

表5 D行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結(jié)果

表6 E行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結(jié)果

表7 F行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結(jié)果

表8 G行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結(jié)果

2.2.4 不同臨床病理參數(shù)與膀胱癌患者生存時(shí)間的關(guān)系: 結(jié)合膀胱癌組織的臨床病理參數(shù)，將膀胱癌樣本分為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，比較2組患者生存時(shí)間。結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者預(yù)后更差(Log-rankP=0.031)。將膀胱癌樣本按病理分期分為Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期。結(jié)果顯示位于Ⅲ、Ⅳ期的膀胱癌患者預(yù)后更差(Log-rankP=0.015)。見(jiàn)圖6。

A. 有、無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移; B. 不同病理分期

3 討 論

Jeon JY等[31]發(fā)現(xiàn)PRMT5在肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)有助于其獲得侵襲性等特征，因此有希望為這些疾病提供新的治療靶點(diǎn)。PRMT5作為一種表觀遺傳酶，能夠?qū)ΨQ性地甲基化組蛋白或者非組蛋白底物的精氨酸殘基，影響靶基因的表達(dá)或者信號(hào)分子的翻譯后修飾，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，發(fā)揮著不同生物學(xué)功能。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)集，證實(shí)PRMT5在膀胱癌中顯著高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度等顯著相關(guān)，即惡性程度越高的患者, PRMT5的表達(dá)越高。本研究顯示PRMT5表達(dá)和預(yù)后生存具有顯著的相關(guān)性, PRMT5高表達(dá)患者預(yù)后差，提示PRMT5基因在膀胱癌中有可能作為臨床預(yù)后指標(biāo)。Dai Shimizu團(tuán)隊(duì)同樣發(fā)現(xiàn)PRMT5可能作為肝細(xì)胞癌的致癌基因, PRMT5 mRNA水平有希望成為一種預(yù)后標(biāo)志物，也可能成為肝細(xì)胞癌分子治療的潛在靶點(diǎn)[32]。本研究采用組織芯片-免疫組化技術(shù)檢測(cè)PRMT5在膀胱癌和癌旁組中的表達(dá)水平，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)PRMT5在2組間存在表達(dá)的差異。接著通過(guò)Log-rank方法比較膀胱癌患者在PRMT5高低表達(dá)組中的生存情況，結(jié)果顯示2組膀胱癌患者生存時(shí)間無(wú)顯著差異。但是結(jié)合膀胱癌組織的臨床病理參數(shù)，顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者預(yù)后更差，位于Ⅲ、Ⅳ期的膀胱癌患者預(yù)后更差。

本研究中還存在著一些不足: 首先，本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)探討PRMT5 mRNA在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的表達(dá)以及與膀胱癌患者生存的關(guān)聯(lián)性，并沒(méi)有在自己樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證; 其次，本研究采用組織芯片-免疫組化技術(shù)檢測(cè)PRMT5表達(dá)水平，探討生存預(yù)后關(guān)系，但結(jié)果都無(wú)顯著差異，這可能與樣本數(shù)量有限，或者前期在挑選樣本時(shí)存在選擇偏倚以及一些隨訪中斷等問(wèn)題有關(guān)。

大量證據(jù)表明PRMT5可能是臨床腫瘤篩查的重要標(biāo)志物，被認(rèn)為是藥物治療的一個(gè)十分有價(jià)值的靶標(biāo)。本研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了PRMT5異常表達(dá)與膀胱癌的臨床參數(shù)及預(yù)后都存在著密切關(guān)系，為進(jìn)一步研究PRMT5在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制以及開(kāi)發(fā)特異性PRMT5抑制劑提供了新線索和新思路。