賀君宇 錢海玲 李小妹 石孟瓊 張永峰 涂 璇 鄒 坤

(1.宜昌市第一中學(xué)，湖北 宜昌 443001；2.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；3.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

腐乳是中國老百姓喜愛的常見傳統(tǒng)美食，其所含大豆異黃酮、大豆皂苷、大豆低聚糖、大豆多肽等成分具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對心腦血管、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)疾病有較好的治療作用[1].目前，國內(nèi)外學(xué)者對于腐乳的研究多集中在菌種選育、產(chǎn)品開發(fā)等研究上，但是對其藥理作用研究較少.由于黃酮和皂苷類成分可有效清除體內(nèi)過量產(chǎn)生的自由基，本文選用鉬酸銨法、1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)法、鐵離子還原(FRAP)法和2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基法分別對腐乳毛霉醇提物不同極性部位進(jìn)行抗氧化活性評價；然后以人肝細(xì)胞L-O2為研究對象，采用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)其損傷，觀察它們對損傷的保護(hù)作用，為今后進(jìn)一步研究開發(fā)提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 藥物和細(xì)胞

腐乳和新鮮豆腐購自宜昌市西陵區(qū)大明菜市場.

1.2 細(xì)胞

L-O2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所.

1.3 試劑

PDA 培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司)；DPPH、ABTS、2，4，6-三吡啶基三嗪、Vit C、二甲基噻唑二苯基四唑嗅鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)；DMEM 培養(yǎng)基(美國Gibco)；乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.4 儀器

潔凈工作臺(上海博訊)；倒置顯微鏡(日本Olympu)；CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo)；多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)；XL-4流式細(xì)胞儀(美國Backman).

1.5 方法

1.5.1 腐乳毛霉的分離純化

用接種針在腐乳中挑取1×1×1cm3大小方塊接種在PDA 培養(yǎng)基上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，然后挑取孢子，用分段劃線法進(jìn)行多次培養(yǎng)分離，直至得到純化的毛霉菌株為止.

1.5.2 腐乳毛霉發(fā)酵及其提取物不同極性部位制備

稱取豆腐5.0kg，加入95.42g葡萄糖混勻后.分別裝入50個錐形瓶中，滅菌后.用接種環(huán)將純化的毛霉菌株接種于豆腐培養(yǎng)基上，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).20d后，收集菌絲和培養(yǎng)基，置于60℃烘箱中干燥，然后用80%乙醇，70℃回流提取3 次，合并提取液，回收乙醇，濃縮至稠膏后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，回收溶劑后，得到石油醚部位3.296g、乙酸乙酯部位8.934g、正丁醇部位28.447g和水部位49.086g.將各萃取物用DMSO 配制成適宜溶液，細(xì)胞實驗的溶液經(jīng)0.22微米孔徑濾膜過濾.

1.5.3 總抗氧化能力測定

按照Lee等[2]介紹的方法測定總抗氧化能力.

1.5.4 清除DPPH、自由基和鐵離子還原能力測定

參照Dehghan 等[3]介紹的方法測定清除DPPH、自由基和鐵離子還原能力.

1.5.5 腐乳毛霉醇提物不同極性部位對L-O2細(xì)胞的影響

取L-O2 細(xì)胞分別加入不同濃度(3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL)的腐乳毛霉醇提物4 個部位的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，用MTT 法測定細(xì)胞活力.1.5.6 腐乳毛霉醇提物不同極性部位對CCl4致L-O2細(xì)胞氧化損傷的影響

將L-O2細(xì)胞先用20mM CCl4作用2h后，分別加入不同濃度(6.25、12.5、25μg/mL)腐乳毛霉醇提物不同極性部位作用24h，然后進(jìn)行相關(guān)實驗.

1)對L-O2細(xì)胞形態(tài)及活力影響.各組L-O2細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，在顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)及進(jìn)行細(xì)胞活力測定，具體檢測方法詳見“1.5.5”.

2)對L-O2細(xì)胞內(nèi)ROS含量影響.各組L-O2細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)的處理后，收集細(xì)胞，進(jìn)行L-O2細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測.具體方法參見試劑盒說明書.

3)對LDH 活性影響.各組L-O2細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)的處理后，收集上清液，按照試劑盒說明書介紹的方法進(jìn)行LDH 活性檢測.

4)對SOD、GSH-Px、CAT 活性和MDA 含量影響.L-O2細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)的處理后，收集上清液，按照試劑盒說明書進(jìn)行SOD、GSH-Px、CAT 活性和MDA 含量檢測.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 腐乳毛霉的性狀特征

在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d 后，肉眼可見菌絲呈白色絮狀，菌絲長度約1～1.5cm.顯微結(jié)構(gòu)：孢囊梗呈假軸狀分枝，孢子囊球形，囊軸呈球形或卵形、無色或淡褐色，孢子近球形、卵形.根據(jù)菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)，可判斷為毛霉(如圖1所示).

2.2 腐乳毛霉提取物不同極性部位的總抗氧化能力

由圖2A 可見，腐乳毛霉醇提物4個部位均具有較強(qiáng)抗氧化能力，由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚部位；經(jīng)統(tǒng)計分析，乙酸乙酯部位較正丁醇部位、正丁醇部位較水部位、水部位較石油醚部位均具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01).

圖2 腐乳毛霉醇提物不同極性部位的總抗氧化和DPPH 自由清除能力

2.3 腐乳毛霉醇提物不同極性部位的DPPH 自由清除能力

由圖2B可見，腐乳毛霉醇提物4個部位均具有較強(qiáng)清除DPPH 能力，由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚部位；經(jīng)統(tǒng)計分析，乙酸乙酯部位較正丁醇部位、正丁醇部位較水部位、水部位較石油醚部位均具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)；Vit C、乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚部位的IC50依次為0.490、0.835、1.416、2.550和4.310.

2.4 腐乳毛霉醇提物不同極性部位的鐵離子還原活性

由圖3A 可見，腐乳毛霉醇提物4個部位均具有較強(qiáng)還原鐵離子能力，由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚部位；經(jīng)統(tǒng)計分析，乙酸乙酯部位較正丁醇部位、正丁醇部位較水部位、水部位較石油醚部位均具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01).

2.5 腐乳毛霉醇提物不同極性部位的ABTS自由基清除能力

由圖3B可見，腐乳毛霉醇提物4個部位均具有較強(qiáng)清除ABTS自由基能力，由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚部位；經(jīng)統(tǒng)計分析，乙酸乙酯部位較正丁醇部位、正丁醇部位較水部位、水部位較石油醚部位均具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)；Vit C、乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚部位的IC50依次為0.377、0.672、1.068、2.092和3.508.

圖3 腐乳毛霉醇提物不同極性部位的鐵離子還原活性和ABTS自由基清除能力

2.6 腐乳毛霉醇提物不同極性部位對L-O2細(xì)胞活性的影響

由圖4可見，腐乳毛霉醇提物不同極性部位在3.125～100μg/mL 的濃度范圍內(nèi)作用L-O2 細(xì)胞24h均未見有細(xì)胞毒性，與空白組(0μg/mL)比較，均具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01).綜合分析腐乳毛霉醇提物不同極性部位的量效關(guān)系，選取6.25、12.5、25μg/mL 3個濃度進(jìn)行后續(xù)實驗.

圖4 腐乳毛霉醇提物不同極性部位對L-O2細(xì)胞活性的影響

2.7 腐乳毛霉醇提物不同極性部位對CCl4 致L-O2細(xì)胞損傷的影響

由圖5A 可見，正常組L-O2細(xì)胞生長良好，細(xì)胞貼壁生長，呈多邊形，分界清楚，表面光滑；模型組細(xì)胞生長緩慢、數(shù)目少，可見核溶解、細(xì)胞膜破損、結(jié)構(gòu)不清晰，皺縮變圓；用腐乳毛霉醇提物4個部位干預(yù)后，細(xì)胞狀態(tài)均出現(xiàn)不同程度的改善.分析細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)模型組細(xì)胞活力降為近50%，與正常組比較具有顯著性差異(P＜0.01)；當(dāng)用腐乳毛霉醇提物4個部位干預(yù)后，其活力明顯提高，與模型組比較，均具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)(圖5B).

2.8 腐乳毛霉醇提物不同極性部位對CCl4 致L-O2細(xì)胞損傷胞內(nèi)ROS的影響

L-O2細(xì)胞經(jīng)CCl4處理后，可見胞內(nèi)ROS升高了4.5 倍，與正常組比較具有顯著性差異(P＜0.01)，當(dāng)用腐乳毛霉醇提物4個部位(6.25、12.5、25 μg/mL)干預(yù)后，ROS水平明顯降低，與模型組比較，均具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚部位(圖6A).

2.9 腐乳毛霉醇提物不同極性部位對CCl4 致L-O2細(xì)胞損傷后培養(yǎng)液中MDA含量和LDH 活性的影響

由圖6B、C 可見模型組L-O2 細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA 含量和LDH 活性明顯升高，與正常組比較具有顯著性差異(P＜0.01)；當(dāng)用腐乳毛霉醇提物的4個部位(6.25、12.5、25μg/mL)干預(yù)后，MDA 含量和LDH 活性明顯降低，與模型組比較，均具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01).

圖6 腐乳毛霉醇提物不同極性部位對CCl4 致L-O2細(xì)胞損傷胞內(nèi)ROS含量和培養(yǎng)液中MDA 含量和LDH 活性的影響

2.10 腐乳毛霉醇提物不同極性部位對CCl4 致LO2細(xì)胞損傷后培養(yǎng)液中SOD、GSH-Px和CAT 活性影響、

由圖7 可見模型組L-O2 細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD GSH-Px和CAT 活性明顯降低，與正常組比較具有顯著性差異(P＜0.01)；當(dāng)用腐乳毛霉醇提物4個部位(6.25、12.5、25μg/mL)干預(yù)后，SOD、GSH-Px和CAT 活性明顯升高，與模型組比較，均具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01).

圖7 腐乳毛霉醇提物不同極性部位對CCl4 致L-O2細(xì)胞損傷后培養(yǎng)液中SOD、GSH-Px和CAT 活性的影響

3 討 論

研究中，將制備得到的腐乳毛霉醇提物的4個部位用鉬酸銨法、DPPH 法、FRAP法和ABTS法分別對其抗氧化能力進(jìn)行了比較分析.研究發(fā)現(xiàn)4個部位均具有較強(qiáng)的抗氧化、清除DPPH 和ABTS自由基及還原鐵離子能力，其抗氧化能力由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚部位.

ROS是導(dǎo)致肝損傷的重要因素之一，雖然細(xì)胞正常情況下也會產(chǎn)生少量ROS，但是它會被胞內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化酶清除；當(dāng)肝臟受到機(jī)體內(nèi)生的或者外源的不良刺激時會導(dǎo)致ROS過量生成，與胞膜上的磷脂雙分子結(jié)合，引起脂質(zhì)過氧化，破壞膜的完整性，使其通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酶(如LDH 等)泄漏.因此，ROS損傷被認(rèn)為是引起肝細(xì)胞損傷的重要因素.在實驗中，發(fā)現(xiàn)L-O2細(xì)胞損傷后，胞內(nèi)ROS 含量和培養(yǎng)基中LDH 的活性明顯升高，當(dāng)用腐乳毛霉醇提物4個部位處理后，ROS含量和LDH 活性均明顯降低.

眾所周知，大量生成的ROS可使導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 大量生成，SOD 是生物體內(nèi)清除ROS的重要物質(zhì)，它清除ROS以減輕其對細(xì)胞造成的損傷，CAT 可使H2O2分解，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2損傷.GSH 和GSSG 是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的非蛋白巰基，當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)或某些代謝紊亂時，巰基與體內(nèi)的ROS等結(jié)合，使其還原為容易代謝的酸類物質(zhì)，從而減輕對細(xì)胞的損傷[4].由此可見，細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT 等抗氧化酶是防止氧化應(yīng)激導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的第一道防線，這些抗氧化酶為清除細(xì)胞內(nèi)過量生成的ROS、減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷提供了保障.在實驗中，發(fā)現(xiàn)4個部位處理組的培養(yǎng)液中SOD、GSH-Px、CAT 的活性明顯升高，MDA含量明顯降低；從高到低依次為乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚部位.實驗提示腐乳毛霉醇提物4個極性部位可通過清除過量生成ROS，減輕CCl4對L-O2細(xì)胞引起的氧化損傷，進(jìn)而發(fā)揮對細(xì)胞保護(hù)作用.此結(jié)果與L-O2細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果相一致.

綜上所述，腐乳毛霉醇提物的4個部位均具有較強(qiáng)的抗氧化、清除DPPH 和ABTS自由基及還原鐵離子能力，對CCl4引起L-O2細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用，證實其作用機(jī)制與其抗氧化作用有關(guān).在腐乳毛霉醇提物4個極性部位中，其作用效果由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚部位.