李建鴻，黃佳，宋長明，楊敏光，金婷婷，柳維林，陶靜，陳立典

認(rèn)知功能障礙是腦卒中后常見的功能障礙之一，大約2/3的腦卒中患者遺留有認(rèn)知功能障礙問題[1-2]。腦卒中是特定腦區(qū)供血障礙的急性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，腦卒中發(fā)生后在缺血腦區(qū)不同類型神經(jīng)元均會出現(xiàn)損傷及死亡，但是研究發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)的錐狀神經(jīng)元對缺血缺氧尤為敏感[3-4]。而海馬在記憶的形成、組織和提取過程中發(fā)揮重要作用，海馬結(jié)構(gòu)和功能的完整性是正常學(xué)習(xí)記憶所必須的，因此海馬神經(jīng)元損傷與腦卒中后學(xué)習(xí)記憶能力下降密切相關(guān)[5-6]。因此本課題選取海馬作為學(xué)習(xí)記憶能力障礙的相關(guān)研究腦區(qū)。突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)，而突觸是突觸可塑性的關(guān)鍵部位[7]，突觸前膜、突觸后膜分布著許多信號分子，海馬突觸素(synaptophysin，SYN)是其家族重要成員之一，其參與突觸傳遞效能的調(diào)控，被認(rèn)為是突觸密度與分布的一個(gè)重要表現(xiàn)，在突觸可塑性中發(fā)揮重要作用，與突觸重塑和認(rèn)知過程密切相關(guān)[8]。有研究表明大鼠腦梗死后的神經(jīng)功能缺損癥狀會伴隨突觸素表達(dá)量明顯下降以及神經(jīng)可塑性破壞[9-10]。故本課題通過觀察大鼠缺血再灌注損傷后學(xué)習(xí)記憶能力的損傷，檢測海馬突觸素SYN的表達(dá)水平，并將二者做相關(guān)性分析，探討缺血再灌注損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動物：將從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物責(zé)任有限公司[許可證號：SCXK(滬)2012-003]購買的體質(zhì)量(250.0±30.0)g的16只SPF級雄性(Sprague-Dawley,SD)大鼠于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SYXK(閩)2013-005]分籠、適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，并對大鼠進(jìn)行編號、稱重進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程均嚴(yán)格按照國際動物保護(hù)和使用指南的規(guī)定操作。②主要試劑和儀器：小鼠來源Anti-Synaptophysin抗體(Abcam，ab8049)、Goat anti-mouse IgG二抗(Proteintech，SA00001-1)、線栓(3600AAA，廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)、7.0 T小動物核磁共振儀(Pharmascan; microMRI, Bruker, Germany)、Barnes迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)、Bio-Image 分析系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories, Hercu-les, CA, USA)。

1.2 方法 造模與分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為模型組(n=10)和對照組(n=6)，參考改良Longa線栓阻塞法[11]，對模型組大鼠行左側(cè)大腦中動脈栓塞法(Middle Celebral Occlusion，MCAO)造模。造模前12h對大鼠禁食并稱重，造模前首先用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉(0.3ml/100g)，待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后沿頸正中切口切開皮膚，暴露出左側(cè)頸總、頸外和頸內(nèi)動脈并使之分離，隨后結(jié)扎頸總、頸外動脈，用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈。在左側(cè)頸總動脈的結(jié)扎處上方用眼科剪剪一“V”型小口，將線栓沿著頸總動脈向頸內(nèi)動脈方向輕緩?fù)迫?，推至頸內(nèi)動脈夾夾閉處時(shí)松開動脈夾，繼續(xù)將線栓推到顱內(nèi)，感到有輕微阻力便停止推入，造成局灶性腦缺血并開始計(jì)時(shí)，縫合皮膚，清潔創(chuàng)口，待90min后抽出線栓。對照組大鼠僅對其左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈進(jìn)行分離，但是不插線栓。待大鼠蘇醒、恢復(fù)活動后，通過Zea-Longa 5分法記錄大鼠得分情況并以此檢測大鼠神經(jīng)功能損傷情況判斷造模是否成功(Zea-Longa評分在1～3分視為造模成功)。造模結(jié)束后，模型組有3只大鼠出現(xiàn)死亡，1只大鼠造模不成功(Zea-Longa評分為0分)，最后模型組造模成功6只全部納入實(shí)驗(yàn)，對照組大鼠6只全部存活納入實(shí)驗(yàn)。

1.3 觀察指標(biāo) ①Zea-longa神經(jīng)行為學(xué)評分：造模后2h，大鼠完全清醒恢復(fù)活動，對其行Zea-Longa神經(jīng)功能缺損評分，根據(jù) Zea-Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)，評分在1～3分之間的大鼠被認(rèn)為造模成功。具體評分分級如下：0分，無神經(jīng)缺損癥狀；1分，右前肢內(nèi)收，懸尾測試后不自覺向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；2分，放在地面后會不自覺的向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，無法走直線，肢體向右側(cè)傾斜；4分，完全無意識，無法行動。② T2W1觀察腦梗死體積：在造模24h后分別對2組大鼠行核磁共振掃描。用5%異氟烷誘導(dǎo)麻醉5min后，2%的異氟烷維持麻醉對3組大鼠進(jìn)行T2WI掃描，用動物生理檢測儀密切觀察掃描大鼠的呼吸、心率。觀察大鼠左側(cè)大腦梗死體積。T2WI掃描參數(shù)：TR 2738 ms，TE 33 ms，TR/TE=4111.669/55ms，F(xiàn)OV=32×32mm，Averages=2，Matrix=256×256，Slices=21，Slice Thickness=0.8mm， Time=5min50s。掃描完成后采用Image J軟件計(jì)算腦梗死體積。③Barnes迷宮檢測學(xué)習(xí)記憶能力：Barnes迷宮的主體是一個(gè)黑色圓形平臺，該平臺直徑為122cm，在平臺周圍分布有20個(gè)等距、等大的圓形鏤空小洞，每個(gè)鏤空小洞的洞口直徑都是10cm，其中一個(gè)洞口下方放置一個(gè)黑色不透光的盒子(目標(biāo)盒)作為大鼠的安全躲避場所；而其它洞的底部不放置盒子。每次檢測前先將大鼠于目標(biāo)盒內(nèi)放置30s，檢測過程中采用噪聲或風(fēng)吹等干擾刺激促使大鼠進(jìn)入目標(biāo)盒、安全躲避。造模后第3天開始迷宮測試，首先把大鼠放置在圓形平臺中央的起始盒內(nèi)，拿走起始盒后開始300s倒計(jì)時(shí)，在這個(gè)過程中記錄其進(jìn)入目標(biāo)盒所用的時(shí)間(逃避潛伏期)和探索錯誤洞口的次數(shù)(口、鼻、四肢對洞口的觸碰均記為探索)，連續(xù)5d。若大鼠在300s內(nèi)未找到目標(biāo)洞口進(jìn)入目標(biāo)盒，記逃避潛伏期為300s。每次測試結(jié)束后都旋轉(zhuǎn)上層圓形平臺并用70%的酒精紗布進(jìn)行擦拭清洗平臺、目標(biāo)盒以防止大鼠憑借氣味尋找到目標(biāo)盒，但要保持目標(biāo)盒的相對空間位置不變。各組進(jìn)入錯誤洞口次數(shù)、逃避潛伏期的計(jì)算方式皆取5d的平均值。④免疫印跡蛋白檢測SYN表達(dá)水平：Barnes迷宮測試結(jié)束后將大鼠麻醉、斷頸后快速分離左側(cè)大腦海馬置于-80℃冰箱保存。每100mg腦組織加1ml細(xì)胞裂解液和10ul 的PMSF儲存液，充分研磨后離心，取上清液，用BAC法測定蛋白濃度。待樣品蛋白變性后，取50ug樣品蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫條件下封閉2h，用SYN(1：1000)和β-action(1:8000)一抗孵育，于4℃冰箱過夜，第2天加入相應(yīng)的二抗(1:2000)于室溫下放置1h。最后將PVDF膜放置在圖像掃描儀上，避光配置顯色液并將其覆蓋于PVDF膜上，反應(yīng)1min，用Image-lab圖像分析系統(tǒng)分析處理。用目標(biāo)條帶灰度值占β-action條帶灰度值的百分比來反應(yīng)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 Zea-longa神經(jīng)行為學(xué)評分 造模2h后，對符合模型組納入標(biāo)準(zhǔn)的6只大鼠重新編號，其Zea-longa神經(jīng)行為學(xué)評分分別為2、2、3、2、1及3分。對照組大鼠6只Zea-longa評分結(jié)果均為0分。

2.2 腦梗死體積 T2W1掃描結(jié)果顯示：造模24h后，模型組大鼠6只出現(xiàn)腦梗死，箭頭所示，對照組大鼠6只無腦梗死。見圖1。

圖1 2組大鼠造模后24h的T2加權(quán)成像

2.3 Barnes迷宮測試結(jié)果 Barnes結(jié)果顯示：對照組尋找目標(biāo)盒路徑清晰直接；模型組路徑雜亂無章、毫無目標(biāo)性，見圖2。與對照組相比，模型組大鼠尋找到目標(biāo)盒的平均潛伏期顯著延長(P<0.01)；模型組進(jìn)入錯誤洞口的平均次數(shù)顯著增加(P<0.01)，見表1。

對照組 模型組

組別n潛伏期(s)進(jìn)入錯誤洞口次數(shù)(次)對照組699.38±11.668.59±1.38模型組6212.43±20.08a23.44±1.25a

與對照組比較，aP<0.01

2.4 SYN表達(dá)水平 免疫印跡蛋白結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組大鼠SYN表達(dá)水平顯著下降(0.56±0.23、1.27±0.33，P<0.01)。

2.5 SYN表達(dá)水平與大鼠學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)性 SYN表達(dá)水平與大鼠逃避潛伏期顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.916，P<0.05)，見圖3；SYN表達(dá)水平與大鼠進(jìn)入錯誤洞口次數(shù)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.87，P<0.05)，見圖4。

圖3 SYN表達(dá)量與大鼠逃避潛伏期相關(guān)性

圖4 SYN表達(dá)水平與進(jìn)入錯誤洞口次數(shù)相關(guān)性

3 討論

海馬在學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能過程中起關(guān)鍵性作用[12]，一項(xiàng)關(guān)于雙側(cè)海馬損傷的人類行為研究顯示海馬損傷與空間記憶缺陷有關(guān)，表現(xiàn)為生活中不能進(jìn)行正確的空間導(dǎo)航而迷路[13]。有關(guān)海馬損傷在嚙齒類動物中的研究更為廣泛，包括空間工作記憶損傷[14]，對于相似環(huán)境的辨別能力障礙等[15]。本課題通過Zea-longa神經(jīng)行為學(xué)評分及核磁共振成像掃描，證明了缺血再灌注模型制備成功，并且模型組大鼠出現(xiàn)不同程度的海馬損傷。隨后本課題通過Barnes迷宮對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降明顯，表現(xiàn)為在迷宮測試過程中逃避潛伏期延長以及進(jìn)入錯誤洞口次數(shù)的增多。

學(xué)習(xí)記憶能力下降會伴隨海馬活動紊亂其很可能與神經(jīng)遞質(zhì)釋放、神經(jīng)調(diào)節(jié)受損密切相關(guān)[16-17]。而突觸小泡介導(dǎo)的遞質(zhì)釋放是神經(jīng)元信息傳遞的主要機(jī)制，在神經(jīng)傳遞的過程中突觸素被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)突觸小泡的循環(huán)效率，被認(rèn)為與突觸可塑性密切相關(guān)。Schmitt等[8]對突觸素基因敲除的小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生組小鼠相比，突觸素基因敲除的小鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶能力下降，在加強(qiáng)曠場實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為對新穎物體的辨識度下降，在水迷宮訓(xùn)練的空間探索實(shí)驗(yàn)過程中逃避潛伏期明顯延長，在定位航行過程中進(jìn)入目標(biāo)象限時(shí)間明顯減少，而視網(wǎng)膜電圖參數(shù)顯示基因敲除小鼠與野生鼠無差異，表明學(xué)習(xí)記憶能力下降并非是由于視力損傷導(dǎo)致的。海馬接受從內(nèi)嗅皮層而來的神經(jīng)投射，該環(huán)路與學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)，Smith等[18]發(fā)現(xiàn)老年大鼠海馬突觸素表達(dá)減少，這可能是老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的重要原因之一。同樣的，有研究分別對3月齡、12月齡和26月齡大鼠海馬突觸素蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著月齡增加，大鼠海馬區(qū)突觸素表達(dá)顯著下降[19]。在人類研究水平上突觸素也被證明與認(rèn)知功能密切相關(guān)，Li等[20]的研究表明了在圍生期及嬰幼兒期鉛暴露過多導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙很可能是由海馬突觸素表達(dá)水平下降引起的。不僅如此，腦組織突觸素蛋白表達(dá)量下降已見于多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床尸檢已證實(shí)阿爾茨海默病患者前額葉和海馬等腦區(qū)突觸素表達(dá)下降，并且其表達(dá)水平與臨床癥狀呈負(fù)相關(guān)[21]。突觸素蛋白在腦缺血再灌注損傷大鼠模型已有相關(guān)研究，Hou等[22]的研究顯示腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)缺損與突觸素蛋白減少有關(guān)。早期研究表明電針、藥物等治療方法均可通過提升大腦突觸素表達(dá)水平改善缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、促進(jìn)運(yùn)動功能的恢復(fù)[23-24]。但是未有研究對缺血再灌注損傷后學(xué)習(xí)記憶能力損傷與突觸素蛋白之間相關(guān)性進(jìn)行研究。

本課題通過蛋白免疫印跡技術(shù)檢測大鼠海馬突觸素表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組大鼠海馬突觸素表達(dá)量顯著下降。并且相關(guān)性分析表明模型組大鼠海馬突觸素表達(dá)水平與大鼠逃避潛伏期、進(jìn)入錯誤洞口次數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。這些研究結(jié)果揭示了：缺血再灌注損傷導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降可能與海馬突觸素SYN表達(dá)水平下降，導(dǎo)致突觸可塑性受損有關(guān)，并且隨著SYN表達(dá)的下降，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損越嚴(yán)重。這一結(jié)果可為后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)。