李憑，李彤，高瑩瑩，張翠英

(工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

紅葡萄酒的釀造過程主要由酵母菌完成的酒精發(fā)酵(alcoholic fermentation, AF)和乳酸菌主導(dǎo)的蘋果酸-乳酸發(fā)酵(簡稱蘋乳發(fā)酵，Malolactic fermentation, MLF)兩部分組成。MLF是AF結(jié)束后，在乳酸菌的作用下將酒中的二元酸L-蘋果酸脫羧降解為一元酸L-乳酸和CO2而啟動的二次發(fā)酵[1-2]。MLF能夠降低葡萄酒的酸度，使新(生)葡萄酒的粗糙、酸澀等特征消失，酒體變得圓潤、柔和，同時還會通過乳酸菌自身的代謝活動釋放揮發(fā)性香氣，改善葡萄酒的風(fēng)味，提高葡萄酒的質(zhì)量[3-5]。

在AF結(jié)束后，酒體較高的酒精度、較低的pH值與殘?zhí)橇渴谷樗峋l(fā)酵受到抑制，發(fā)酵周期延遲，故在發(fā)酵結(jié)束時由MLF產(chǎn)生的酯等風(fēng)味物質(zhì)含量減少，降低葡萄酒的風(fēng)味質(zhì)量[6];另外，在AF結(jié)束后，酒體中存在的噬菌體也會造成MLF推遲或被抑制，腐敗菌發(fā)酵產(chǎn)生異香和異味，導(dǎo)致葡萄酒病害的發(fā)生[7-8]。

植物乳桿菌是葡萄酒中進(jìn)行MLF常見的乳酸菌之一，由于植物乳桿菌可以在葡萄酒高酒精含量、低pH值、高溫等苛刻的條件下生長，具有潛在啟動MLF的能力，成為近幾年研究的新一代可以代替酒類酒球菌的理想的MLF發(fā)酵劑[9-10]。本文通過對比分析于酒精發(fā)酵不同時間接入植物乳桿菌時，酵母和乳酸菌混合發(fā)酵對葡萄酒發(fā)酵周期和風(fēng)味物質(zhì)的影響，確定接入植物乳桿菌的最佳時間，從而提高葡萄酒的風(fēng)味質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌株

本實驗室保藏的葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)編號為WY1；由實驗室從玫瑰香葡萄中篩選得到的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)編號為ZL1。無營養(yǎng)缺陷標(biāo)記。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，pH自然，115 ℃滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉4 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，胰蛋白胨15 g/L，醋酸鈉5 g/L，牛肉膏5 g/L，檸檬酸銨2 g/L，吐溫-80體積分?jǐn)?shù)為0.1%，調(diào)節(jié)pH至4.8左右，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄汁糖質(zhì)量濃度為210 g/L。

1.1.3 儀器及試劑

FA2004電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；IS-RDS3恒溫?fù)u床，上海制成儀器制品有限公司；YXQ-LS-75SⅡ高壓滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；7890A氣相色譜儀，北京安捷倫科技有限公司；1100LC高效液相色譜儀，美國Agilent公司；L-蘋果酸試劑盒(Megazyme)，愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)

酵母：一級種子培養(yǎng)液，挑取1環(huán)酵母接種于裝有5 mL YEPD試管；二級種子培養(yǎng)液，將一級種子按5%(V/V)接到裝有50 mL YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃，180 r/min，至細(xì)胞濃度2.0×109CFU/mL。

植物乳桿菌：一級種子培養(yǎng)液，挑取1環(huán)植物乳桿菌于裝有MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)末期；二級種子培養(yǎng)液，以5%(V/V)接種量接種于50 mL培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)至細(xì)胞濃度1.2×107CFU/mL。

1.2.2 葡萄酒發(fā)酵

用蔗糖調(diào)節(jié)葡萄汁初糖濃度至210 g/L，用酒石酸調(diào)節(jié)pH至 3.51，SO2添加量為80 mg/L；將酵母種子培養(yǎng)液按5%(V/V)接種量接入裝有190 mL葡萄汁的250 mL三角瓶中，25 ℃生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵，在酒精發(fā)酵第1天、第2天…第5天分別以5%(V/V)接種量接入植物乳桿菌ZL1。每1天的發(fā)酵做3個平行試驗。

1.3 分析方法

1.3.1 發(fā)酵速率的測定

CO2失重法：發(fā)酵過程中每隔24 h稱重并記錄數(shù)據(jù)，計算發(fā)酵瓶累積失重量(即CO2的釋放量)。然后以發(fā)酵瓶累積失重為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，繪制發(fā)酵速率曲線。

1.3.2L-蘋果酸含量測定

L-蘋果酸試劑盒(Megazyme)檢測：準(zhǔn)備2個干凈試管，1根試管加入2.1 mL的蒸餾水(空白對照)，另外1根加入2 mL的蒸餾水和0.1 mL的發(fā)酵液(稀釋F倍)，分別依次加入0.1 mL的溶液1(緩沖液)、0.1 mL的溶液2(NAD+/PVP)和0.02 mL的溶液3 (草酰乙酸氨基轉(zhuǎn)移酶)，混勻后反應(yīng)3 min，在335 nm波長處，用1 cm比色皿測定樣品吸光度A1，分別加入0.02 mL的溶液4(L-蘋果酸脫氫酶)，混勻后反應(yīng)3 min，在相同條件下測定樣品吸光度A2。

ρ(L-蘋果酸)/(g·L-1)=0.498 0×(A2-A1)×F

(1)

1.3.3 pH值的測定

應(yīng)用酸度計檢測發(fā)酵后發(fā)酵液的pH值。

電極活化：第1次使用或長期停用的酸度計電極，使用前在飽和的氯化鉀溶液中浸泡24 h,對電極進(jìn)行活化。

標(biāo)定：用蒸餾水清洗電極，插入已配好的pH值為6.86的緩沖溶液中，調(diào)節(jié)儀器使顯示讀數(shù)與該緩沖溶液當(dāng)時溫度下的pH值相一致，然后用蒸餾水清洗電極后，插入pH值為4.01的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液中，調(diào)節(jié)儀器使顯示讀數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液當(dāng)時溫度下的pH值相一致。

樣品測定：蒸餾水清洗電極后用發(fā)酵液清洗2～3次，將電極插入發(fā)酵液中，玻璃棒攪拌溶液，在顯示屏上讀出發(fā)酵液的pH值。

1.3.4 酒精度的測定

應(yīng)用酒精比重計法測定發(fā)酵后葡萄酒的酒精度：準(zhǔn)確量取100 mL發(fā)酵液于1 000 mL的蒸餾瓶中，并同時加入等量的蒸餾水置于電爐上蒸餾，接入冷凝管，用冰浴的量筒收集100 mL餾出液后，測定酒精度和相應(yīng)溫度，然后換算成20 ℃時的酒精度[11]。

1.3.5 還原糖的測定

斐林試劑法測定發(fā)酵液中還原糖的含量：

斐林試劑標(biāo)定：吸取斐林試劑液(0.1 g/mL NaOH溶液)、乙液(0.05 g/mL CuSO4溶液)各5 mL，置于150 mL三角瓶中，準(zhǔn)確加入10 mL蒸餾水，搖勻，待加熱至沸騰后，用1 g/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定至藍(lán)色或紫紅色消失，記下滴定葡萄糖溶液的體積。

樣品測定：吸取斐林甲、乙溶液各5 mL于150 mL三角瓶中，加入1 mL樣品稀釋液和9 mL蒸餾水，其余操作同上。還原糖含量按公式(2)計算。

(2)

式中：X,樣品中還原糖的含量，g/L;V0,空白液消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積，mL；V,樣品稀釋液消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積，mL；ρ,標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的質(zhì)量濃度，g/L；n,樣品稀釋倍數(shù)；Vs,所取試樣稀釋液體積，mL。

1.3.6 風(fēng)味物質(zhì)的測定[6]

高效氣相色譜法：葡萄酒發(fā)酵液經(jīng)蒸餾后采用氣相色譜法測定。內(nèi)標(biāo)物為乙酸正戊酯；色譜柱19091N-213：30 m×320 μm×0.5 μm，配FID檢測器；載氣為高純氮，流速2.5 mL/min。初始柱溫50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的升溫速度升至80 ℃，保持2 min，最后以10 ℃/min的升溫速度升至100 ℃。檢測器溫度為250 ℃，進(jìn)樣口溫度為230 ℃，進(jìn)樣量0.4 μL，分流比20∶1。

1.3.7 有機酸的測定

高效液相色譜法：葡萄酒發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm的纖維濾膜過濾后用高效液相色譜測定。色譜柱為Bio-Rad HPX-87H，300 mm×7.8 mm；檢測器為示差折光檢測器(RID)；流動相為5 mmol/L硫酸，流速為0.6 mL/min；檢測器溫度為45 ℃，柱溫為65 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗取3次重復(fù)試驗平均值，數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)形式表示，P<0.05表示差異有顯著性；并使用Origin 8.5和Excel分別進(jìn)行圖和表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵速率測定

發(fā)酵過程中每隔24 h稱重并記錄數(shù)據(jù)，計算CO2累積失重量(即發(fā)酵瓶累積失重量)。然后以CO2累積失重為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，繪制發(fā)酵速率曲線(如圖1)。

圖1 不同接菌時間下發(fā)酵速率比較
Fig.1 Comparison of fermentation speed of different
timing of bacterial inoculation

由圖1可知，隨著接種植物乳桿菌時間的延后葡萄酒發(fā)酵速率逐漸變慢，第1天接入植物乳桿菌時，葡萄酒發(fā)酵速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于其他接菌時間的發(fā)酵速率，其中未加植物乳酸菌時發(fā)酵速率最慢(P<0.05)。因此，選擇在發(fā)酵第1天接入植物乳桿菌使酵母乳酸菌混合發(fā)酵，葡萄酒的發(fā)酵速率最快。

2.2 L-蘋果酸的變化趨勢

L-蘋果酸是葡萄酒產(chǎn)生強烈辛酸味的重要組分，且L-蘋果酸在葡萄酒發(fā)酵期間的變化是衡量蘋乳發(fā)酵是否完成的重要標(biāo)準(zhǔn)[12]，應(yīng)用L-蘋果酸試劑盒(Megazyme)檢測發(fā)酵期間各發(fā)酵液中L-蘋果酸的含量，結(jié)果見圖2。

圖2 不同接菌時間對葡萄酒中L-蘋果酸的影響
Fig.2 Effect of different timing of bacterial inoculation
on theL-malic acid

由圖2看出，在葡萄酒發(fā)酵過程中，隨著接菌時間的延后，L-蘋果酸含量下降逐漸變慢，其中于第1天接入植物乳桿菌時，發(fā)酵液中L-蘋果酸含量降解速率最快(P<0.05)，在第15天，即可將發(fā)酵液的蘋果酸含量由最初的5.40 g/L降到1.30 g/L左右；而在第4天和第5天接入植物乳桿菌時，發(fā)酵液的L-蘋果酸含量在第30天降到2.35 g/L左右。隨著接入植物乳桿菌時間的延后，酵母AF產(chǎn)生的酒精量逐漸增加，殘?zhí)橇恐饾u減少，pH值逐漸降低且酵母此時的發(fā)酵活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于植物乳桿菌接入時的活力，這些條件都會對植物乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)生抑制，使MLF周期延長，L-蘋果酸降解速率變慢。由此可知在葡萄酒發(fā)酵第1天加入植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，可以更好地發(fā)揮MLF的作用，加快發(fā)酵速率，縮短發(fā)酵周期。

2.3 殘?zhí)橇亢途凭鹊臏y定

按方法1.3測定發(fā)酵后各發(fā)酵液的殘?zhí)恰⒕凭群蚿H值，結(jié)果如表1。

表1 不同接菌時間發(fā)酵性能比較Table 1 Comparison of fermentation performances of yeast strains

在第1天至第4天接入植物乳桿菌的發(fā)酵液與未加植物乳桿菌的發(fā)酵液相比殘?zhí)橇亢途凭群科?，其中?天接菌的酒樣殘?zhí)橇颗c酒精度最低(P<0.05)。酵母AF主要是一個耗糖的過程，而植物乳桿菌發(fā)酵除了降解蘋果酸，也會在無氧條件下消耗一部分糖而生成乳酸，在第1天接入植物乳桿菌時，受酵母發(fā)酵的影響較小，菌活性較高、發(fā)酵能力強，因此消耗的糖分較多，進(jìn)而使得酵母AF后產(chǎn)生的酒精含量偏低。同時通過測定各發(fā)酵液的pH值發(fā)現(xiàn)，加入植物乳桿菌發(fā)酵與不加植物乳桿菌發(fā)酵相比，發(fā)酵液的pH值明顯提高(P<0.05)。加入植物乳桿菌進(jìn)行MLF，將酸性尖銳的蘋果酸轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵛度岷偷腖-乳酸，該過程1 g的蘋果酸生成0.67 g乳酸，發(fā)酵液的pH值升高。在第1天至第5天分別加入植物乳桿菌的酒樣中，發(fā)酵液的pH值由大變小，隨著AF的進(jìn)行，發(fā)酵液酒精度逐漸升高，殘?zhí)橇恐饾u變小，此時加入的植物乳桿菌發(fā)酵受抑制，使MLF的降酸效果變差。

2.4 有機酸的測定

使葡萄酒具有酸性特征的有機酸類是葡萄酒的主要組分，有機酸類的性質(zhì)及其濃度調(diào)節(jié)著發(fā)酵液的“酸堿平衡”，影響葡萄酒的口感、色澤及生物穩(wěn)定性，進(jìn)而影響葡萄酒的質(zhì)量。對于紅葡萄酒來說，總酸量低，則酒體柔和、圓潤，相反總酸量高，則酒體粗糙，酸澀[13-14]。發(fā)酵后各發(fā)酵液中有機酸的含量測定結(jié)果見表2。

表2 不同接菌時間發(fā)酵液中有機酸的含量Table 2 Effect of different timing of bacterial inoculation on the organic acid

由表2看出，與未加ZL1菌相比，在MLF后：蘋果酸、檸檬酸明顯下降，其中第1天加入植物乳桿菌，發(fā)酵后兩者含量下降最多(P<0.05)；酒石酸和琥珀酸略有下降，第1天加入植物乳桿菌發(fā)酵后發(fā)酵液中酒石酸和琥珀酸變化最大(P<0.05)；乙酸含量略有增加(P<0.05)。MLF主要是在植物乳桿菌的作用下將具有強烈辛酸味的二羥基酸-蘋果酸分解成酸味柔和的單羥基酸-乳酸，使得MLF后L-蘋果酸含量下降，L-乳酸含量上升[13]。

對比未加植物乳桿菌的發(fā)酵情況(發(fā)酵后L-蘋果酸含量為4.219 g/L，檸檬酸含量為0.258 g/L，L-乳酸含量為0.171 g/L)，加入植物乳桿菌進(jìn)行MLF，L-蘋果酸和檸檬酸含量降低，L-乳酸含量增加：在第3天、第4天和第5天加入植物乳桿菌時，發(fā)酵后L-蘋果酸含量分別為1.875、2.131和2.332 g/L，檸檬酸含量分別為0.223、0.206和0.220 g/L，L-乳酸含量分別為0.842、0.464和0.363 g/L，而第1天和第2天加入植物乳桿菌，發(fā)酵后L-蘋果酸和檸檬酸含量明顯降低(P<0.05)，L-乳酸含量明顯增高(P<0.05)。尤其是在第1天加植物乳桿菌后，發(fā)酵后發(fā)酵液的L-蘋果酸含量為1.307 g/L，檸檬酸含量為0.087 g/L，L-乳酸含量為2.164 g/L。而3種有機酸的酸味強弱的排列次序為蘋果酸>檸檬酸>乳酸，故發(fā)酵第1天接入植物乳桿菌時，酵母和植物乳桿菌同時發(fā)酵，植物乳桿菌受到AF的抑制作用較小使得MLF作用更強，從而對葡萄酒的降酸效果更好。

2.5 風(fēng)味物質(zhì)含量的測定

發(fā)酵后各發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的含量，結(jié)果見圖3。

圖3 不同接菌時間的發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)含量的測定
Fig.3 Effect of different timing of bacterial inoculation on
the production of higher alcohols (A) and ester (B)

分別在第1天至第5天接植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液中的高級醇含量逐漸增大，酯含量逐漸變小。其中第1天接入植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后高級醇的含量最低(P<0.05)，即正丙醇含量為34.016 mg/L、異丁醇為24.431 mg/L、異戊醇為202.018 mg/L和苯乙醇為12.749 mg/L。高級醇是酵母AF的主要副產(chǎn)物，也是葡萄酒主要的風(fēng)味物質(zhì)，而過量的高級醇會給葡萄酒帶來異味，并易使人頭疼和醉酒。在糖發(fā)酵時接入植物乳桿菌，酵母和植物乳桿菌相互競爭，酵母可利用的糖分變少，發(fā)酵后高級醇的含量變低；因AF尚未完成，植物乳桿菌發(fā)酵受到的抑制作用較小，使得MLF比常規(guī)的順序發(fā)酵發(fā)酵能力更強，較多的蘋果酸降解為乳酸，進(jìn)而生成乳酸乙酯,尤其是在第1天接入植物乳桿菌時，發(fā)酵后乳酸乙酯的含量達(dá)到24.313 mg/L，同時乙酸異戊酯的含量也略有提高。酯含量是葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)的重要來源，較高的酯含量對葡萄酒的風(fēng)味質(zhì)量起到非常重要的作用。

3 結(jié)論

本研究通過在酒精發(fā)酵不同時間接入植物乳桿菌，使酵母和乳酸菌混合發(fā)酵，平衡酒精發(fā)酵和蘋乳發(fā)酵的作用，研究其對葡萄酒發(fā)酵性能的影響。通過比較發(fā)現(xiàn)，加入植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，能夠降低葡萄酒的酸度，使新(生)葡萄酒的粗糙、酸澀等特征消失，使酒變得圓潤、柔和。與常規(guī)發(fā)酵相比，選擇在第1天接入植物乳桿菌，使葡萄汁酵母和植物乳桿菌混合發(fā)酵，由于酵母和植物乳桿菌相互競爭，酵母可利用的糖分變少，發(fā)酵后高級醇的含量變低，且因AF尚未完成，植物乳桿菌發(fā)酵受到的抑制作用較小，使得MLF比常規(guī)的順序發(fā)酵發(fā)酵能力更強，較多的蘋果酸降解為乳酸，進(jìn)而生成更多的乳酸乙酯，起到了更好的降酸效果。故葡萄汁酵母和植物乳桿菌混合發(fā)酵在縮短發(fā)酵周期的同時，可提高葡萄酒的風(fēng)味。