金婷，孫欣，李卓瓦，馮曉慧，譚勝兵，王明林*

1(棗莊學(xué)院 食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東 棗莊，277000)2(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安，271000)

石榴(Punicagranatum)又名安石榴、丹若、金罌，為石榴科(Punicacae)[1]植物，是一種深受人民喜愛的一種水果，石榴不僅能作為生鮮果實(shí)，而且能加工成各種產(chǎn)品，如石榴汁、石榴酒、石榴果醋等，另外石榴中富含多酚、花色苷等活性物質(zhì)，具有消炎、抗癌、抗氧化等多種生理功能[2]。鑒于石榴的食藥兩用功能，人們對(duì)其需求量日益增加，為了增加產(chǎn)量，石榴園田間大量使用除草劑、殺菌劑、殺蟲劑等各種農(nóng)藥以保證石榴的豐產(chǎn)[3-4]，其中有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)防治果園的病蟲害具有經(jīng)濟(jì)、高效、方便等特點(diǎn)，因此在石榴園中的使用尤為常見。有機(jī)磷農(nóng)藥在我國的使用量占農(nóng)藥總數(shù)的50%，而劇毒有機(jī)磷農(nóng)藥占整個(gè)農(nóng)藥產(chǎn)量的35%，其中以對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、樂果等高毒性品種使用最多[5]。對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量進(jìn)行監(jiān)控成為石榴產(chǎn)業(yè)中重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，而對(duì)其建立一種快速、高效、靈敏度高的多殘留農(nóng)藥檢測(cè)技術(shù)顯得十分重要。

目前最常采用的有機(jī)磷農(nóng)藥測(cè)定方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6-9]；常用前處理方法有：固相萃取、基質(zhì)固相分散、超臨界流體萃取、微波輔助萃取和分子印跡固相萃取等。QuEChERS方法自2003年被推出后，就以其快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠和安全的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于水果和蔬菜的農(nóng)藥殘留測(cè)定[10-18]。沈丹玉等[19]運(yùn)用QuEChERS前處理法結(jié)合氣相色譜技術(shù)建立了針對(duì)雞腿菇中14種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的快速分析方法。吳春梅等[20]采用QuEChERS方法結(jié)合在線凝膠滲透色譜-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，快速測(cè)定蔬菜中24種多農(nóng)藥殘留。劉永等[21]測(cè)定了蔬菜中4種有機(jī)磷農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物。

目前針對(duì)石榴的研究大都集中在其加工產(chǎn)品和有效成分的研究中，而國內(nèi)對(duì)石榴農(nóng)殘測(cè)定方法的研究為數(shù)不多，本文對(duì)石榴中多種有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行測(cè)定，對(duì)經(jīng)典的QuEChERS前處理方法條件進(jìn)行有針對(duì)性的調(diào)整，采用氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法進(jìn)行樣品測(cè)定，旨在建立一種簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好，且能同時(shí)測(cè)定石榴中19種有機(jī)磷殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

TQ8030三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，配有EI源(日本島津公司)；WH-866渦旋混勻器(上海生析超聲儀器有限公司)；SE202FZH電子天平(奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司)；NDK200-2氮吹濃縮儀(上海皓莊儀器有限公司)；TDL-40B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 材料及試劑

實(shí)驗(yàn)所用石榴樣品均購于本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

乙酸乙酯、乙腈、丙酮：色譜純，天津Bonna-Agela公司；乙酸銨、MgSO4、Na2SO4、NaCl、C18、N-丙基乙二胺(PSA)、弗羅里硅土：分析純，天津Bonna-Agela公司。

敵敵畏、滅線磷、久效磷、甲拌磷、甲基乙拌磷、樂果、乙拌磷、安果、除線磷、殺螟硫磷、毒死蜱、倍硫磷、對(duì)硫磷、稻豐散、喹硫磷、溴硫磷、抑草磷、乙硫磷、三唑磷(純度≥95，外標(biāo))，德國DrEhrenstorfer GmbH公司。

1.3 樣品前處理

將石榴果粒完整取出，去掉石榴籽后放入組織搗碎機(jī)內(nèi)搗碎。準(zhǔn)確稱取搗碎后的10 g樣品放入50 mL離心管中，加入10 mL乙酸乙酯進(jìn)行均質(zhì)30 s。再加入4 g MgSO4和1 g NaCl渦旋1 min，在5 000 r/min離心5 min，取1 mL上層清液轉(zhuǎn)移至裝有75 mg PSA的離心管中，渦漩振蕩30 s，于5 000 r/min再次離心5 min，取上層清液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液進(jìn)行GC-MS/MS分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

準(zhǔn)確稱取約10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用丙酮定容；取相應(yīng)量的單標(biāo)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用丙酮配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中避光保存。

使用時(shí)，為消除基質(zhì)效應(yīng)，將標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液用按1.3方法處理后的石榴提取液溶液稀釋至質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃條件下保存。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Rtx-5MS(30 m×0. 32 mm×0.25 μm)；載氣：氦氣(He)；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；程序升溫：初始60 ℃；保持1 min；然后以25 ℃/min升溫到180 ℃；再以10 ℃/min升溫至280 ℃/min并保持5 min；色譜柱流量：1 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；不分流進(jìn)樣。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：250 ℃；溶劑延遲時(shí)間：3 min；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；碰撞氣：氬氣。19種有機(jī)磷農(nóng)藥在串聯(lián)質(zhì)譜條件下的定性離子對(duì)和定量離子對(duì)等質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間見表1。

表1 19種有機(jī)磷農(nóng)藥的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 19 organophosphoruspesticides

續(xù)表1

編號(hào)化合物保留時(shí)間/min母離子(m/z)子離子(m/z)碰撞電壓/eV17抑草磷12.416286.10202.10?(14)185.00(30)258.10(8)18乙硫磷13.505230.90174.90?(14)184.90(12)129.00(24)19三唑磷13.784257.00162.00?(8)134.00(22)119.00(26)

注：*為定量離子

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)相似相溶原則，一般選用乙腈、乙酸乙酯、丙酮為農(nóng)藥提取劑。本實(shí)驗(yàn)采用此3種溶劑作為QuEChERS前處理的萃取溶劑并進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙酮提取液的顏色最深，因丙酮極性強(qiáng)，將石榴中的水溶性色素和雜質(zhì)大量提取出來，且后期很難與水進(jìn)行分離，凈化過于困難[22]。乙腈和乙酸乙酯提取液顏色都較淺，對(duì)這2種溶劑提取后的回收率進(jìn)行了測(cè)定，部分結(jié)果見圖1。從圖中可以看出，其中乙酸乙酯為溶劑的農(nóng)藥回收率大多高于乙腈，且使用乙酸乙酯作為溶劑可直接進(jìn)行GC-MS/MS分析，不需要溶劑交換，并且安全、環(huán)保，所以本實(shí)驗(yàn)選擇使用乙酸乙酯為提取溶劑。

圖1 不同提取劑對(duì)6種典型含磷農(nóng)藥回收率
的影響
Fig.1 Influence of different extractants on the recovery
rate of six typical phosphorus pesticides

2.2 凈化劑的選擇

本研究比較了PSA、C18、弗羅里硅土及中性氧化鋁4種凈化劑的效果。其中PSA具有弱的陰離子交換能力，通過氫鍵與目標(biāo)物作用可除去脂肪酸、有機(jī)酸、糖和色素。應(yīng)用于石榴樣品中凈化效果較好，不需要另加其他的凈化劑便可達(dá)到要求；而另外3種凈化劑盡管對(duì)樣品中酯類物質(zhì)、甾醇及芳香族等物質(zhì)具有清除能力[23]，但去除后溶液顏色均較深，需要進(jìn)一步凈化或要應(yīng)用多種凈化劑復(fù)合凈化，使得提取液中的目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生損失而導(dǎo)致回收率降低。綜合考慮，選擇PSA作為吸附劑。

2.3 凈化劑用量的選擇

本實(shí)驗(yàn)考查了PSA用量分別為25、50、75、100、125 mg時(shí)的凈化效果，部分結(jié)果見圖2。從結(jié)果可以看出，當(dāng)PSA用量為75 mg時(shí)，回收率普遍最高，而當(dāng)PSA用量繼續(xù)升高時(shí)，對(duì)目標(biāo)物質(zhì)會(huì)有一定的損失，導(dǎo)致回收率下降。故本實(shí)驗(yàn)采用75 mg的PSA對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

圖2 凈化劑用量對(duì)6種典型含磷農(nóng)藥回收率
的影響
Fig.2 Influence of the amount of detergent on the
recovery rate of six typical phosphorus pesticides

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中被分析物以外的組分對(duì)分析過程及結(jié)果準(zhǔn)確性的影響和干擾[24]。石榴果實(shí)的基質(zhì)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中有一定干擾，本實(shí)驗(yàn)采用石榴基質(zhì)樣品，按照前處理方法進(jìn)行提取、凈化等步驟，以保證目標(biāo)農(nóng)藥在測(cè)定排除基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的干擾，并且用它做成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，用它對(duì)樣品進(jìn)行計(jì)算，來減弱基質(zhì)效應(yīng)的影響[25-26]。

2.5 方法驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，在有效的線性范圍內(nèi)，對(duì)石榴提取物按低、中、高3個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，考慮到待測(cè)物質(zhì)含量較少，接近方法的檢出限，因此選擇0.01、0.02、0.05 mg/kg 3個(gè)較低濃度的級(jí)別進(jìn)行添加，每個(gè)添加平行進(jìn)行3次，以3倍的信噪比確定為方法的檢出限，以10倍信噪比確定定量限，其線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、添加回收率等結(jié)果見表2，MRM模式總離子流圖見圖3。

表2 十九種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)(r)、添加回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)Table 2 Linear ranges, correlation coefficients(r), average recoveries, relative standard deviations, limits ofdetection(S/N=3) and limits of quantification(S/N=10)for the 19 pesticides

續(xù)表2

編號(hào)化合物相關(guān)系數(shù)/(r)添加水平/(mg·kg-1)回收率/%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)/%檢出限/(μg·kg-1)定量限/(μg·kg-1)19三唑磷0.996 70.010.020.05110.5120.9118.26.02.41.11.75.6

A-標(biāo)樣1.0 mg/L；B-石榴添加回收 0.05 mg/kg;1-敵敵畏；2-滅線磷；3-久效磷；4-甲拌磷；5-甲基乙拌磷；6-樂果；7-乙拌磷；8-安果；9-除線磷；10-殺螟硫磷；11-毒死蜱；12-倍硫磷；13-對(duì)硫磷；14-稻豐散；15-喹硫磷；16-溴硫磷；17-抑草磷;18-乙硫磷;19-三唑磷圖3 總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms

從表2可以看出，19種有機(jī)磷農(nóng)藥在0.01～1.0 mg/L的線性范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，均達(dá)到0.99以上；19種含磷農(nóng)藥的平均回收率為73.5%～120.9%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～15.7%。表明該方法有良好的精密度和準(zhǔn)確度，能滿足19種含磷農(nóng)藥的檢測(cè)要求。

2.6 實(shí)際石榴樣品的殘留檢測(cè)

依據(jù)上述優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)從市場(chǎng)上購買的石榴樣品進(jìn)行了檢測(cè)，在所測(cè)定的石榴中共檢出久效磷和樂果2種農(nóng)藥，濃度分別為9.03 μg/kg和4.74 μg/kg，其余均未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)石榴中19種含磷農(nóng)藥殘留量的分析方法，采用外標(biāo)法定量，MRM監(jiān)測(cè)模式。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)對(duì)前處理方式進(jìn)行了優(yōu)化，與QuEChERS方法中普遍采用以乙腈為提取溶劑的方式相比，在本實(shí)驗(yàn)中選用的乙酸乙酯對(duì)于石榴果實(shí)中目標(biāo)物質(zhì)的提取更為有效，而對(duì)后續(xù)凈化處理的效率得到提高，以PSA為凈化劑，用量75 mg即可達(dá)到較為理想的效果。結(jié)果表明19種含磷農(nóng)藥在0.01～1.0 mg/L的線性范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系；其測(cè)定的平均回收率為73.5%～120.9%。該方法操作簡(jiǎn)便安全，準(zhǔn)確度及精密度較好，適合進(jìn)行石榴中19種有機(jī)磷類農(nóng)藥的快速檢測(cè)。