劉波 王萍 李霞 張杰 李麗

(1兗礦集團(tuán)有限公司總醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 鄒城 273517；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科)

肥胖、糖尿病、高血壓等均會(huì)引起慢性腎臟疾病發(fā)生，腎小管間質(zhì)纖維化是慢性腎臟疾病發(fā)展到終末期的共同特征，腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與腎小管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有關(guān)，在此過(guò)程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志特征逐漸消失，細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)〔1，2〕。腎小管上皮細(xì)胞纖維化發(fā)生的誘導(dǎo)因素有很多，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1是重要的誘發(fā)因子，也是常用的體外研究腎小管上皮細(xì)胞纖維化的誘導(dǎo)因子〔3〕。腎臟損傷因子(KIM)-1是一種跨膜蛋白，可以反映腎功能的變化，在腎損傷中具有重要意義〔4，5〕。研究顯示，KIM-1在腎纖維化組織中表達(dá)上調(diào)，并且可以用于判斷腎功能的損傷情況〔6〕。本實(shí)驗(yàn)探討KIM-1在TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞纖維化和EMT中的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料 大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK52E購(gòu)自成都正能生物；TGF-β1購(gòu)自美國(guó)Pepreotech；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白(Ig)G購(gòu)自美國(guó)Jackson；上皮鈣黏附素(E-cadherin)抗體、α-SMA抗體購(gòu)自美國(guó)BD；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)抗體、1型膠原酶(Col1)抗體、3型膠原酶(Col3)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組 大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK52E培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。NRK52E細(xì)胞分為：對(duì)照組、對(duì)照組+TGF-β1、陰性組+TGF-β1、干擾組+TGF-β1，對(duì)照組+TGF-β1、陰性組+TGF-β1、干擾組+TGF-β1細(xì)胞分別用TGF-β1刺激，刺激方法為：在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加10 ng/ml的TGF-β1繼續(xù)孵育72 h。陰性組+TGF-β1、干擾組+TGF-β1細(xì)胞在TGF-β1刺激前，分別轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)照和KIM-1 siRNA，細(xì)胞轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，具體步驟同Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書。

1.3qRT-PCR法檢測(cè) TGF-β1刺激后的腎小管上皮細(xì)胞中KIM-1的表達(dá)水平 對(duì)照組、對(duì)照組+TGF-β1細(xì)胞處理方法同上，提取細(xì)胞的RNA，步驟簡(jiǎn)述如下：在細(xì)胞中添加TRIZOL，用移液槍反復(fù)吹打混合后，轉(zhuǎn)移到離心管中，以低溫4℃，離心10 min，棄上清，加入三氯甲烷，上下顛倒混合后，置于冰上孵育15 min，低溫4℃，離心10 min，吸取上清溶液，與異丙醇混合沉淀RNA，乙醇洗滌，用DEPC水溶解。取RNA，在72℃變性約10 min后，42℃孵育60 min，95℃孵育5 min，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取cDNA，用熒光定量PCR測(cè)定計(jì)算KIM-1 mRNA水平，步驟同熒光定量PCR試劑盒。

1.4Western印跡法檢測(cè)TGF-β1刺激后的腎小管上皮細(xì)胞中KIM-1的表達(dá)水平 對(duì)照組、對(duì)照組+TGF-β1細(xì)胞處理方法同上，用PBS洗滌3次以后，在細(xì)胞中添加細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30 min后，置于低溫4℃離心10 min，吸取上清，保存在-80℃。用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取蛋白樣品，以每個(gè)泳道添加30 μg蛋白樣品進(jìn)行蛋白電泳，電泳用10%的分離膠、5%的濃縮膠。上樣前，把蛋白樣品與上樣緩沖液在100℃孵育5 min。用轉(zhuǎn)膜儀把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，電流調(diào)整為350 mA。用5%脫脂奶粉封閉后，再分別與一抗和二抗反應(yīng)，一抗以1∶600稀釋，二抗以1∶2 000稀釋。ECL顯色，Alpha-view對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。

1.5Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin、α-SMA和纖維化因子CTGF、Col1、Col3的表達(dá) 對(duì)照組、對(duì)照組+TGF-β1、陰性組+TGF-β1、干擾組+TGF-β1細(xì)胞處理方法同上，用Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞中EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin、α-SMA和纖維化因子CTGF、Col1、Col3的表達(dá)，E-cadherin、α-SMA一抗以1∶800稀釋，CTGF、Col1、Col3一抗以1∶1 000稀釋。步驟同上。

1.6統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1KIM-1在TGF-β1作用后的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào) 對(duì)照組+TGF-β1細(xì)胞中KIM-1蛋白和mRNA水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)KIM-1。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)KIM-1在TGF-β1作用后的腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

組別KIM-1 mRNAKIM-1蛋白對(duì)照組1.00±0.000.28±0.02對(duì)照組+TGF-β14.36±0.241)0.97±0.051)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.2轉(zhuǎn)染KIM-1 siRNA后的腎小管上皮細(xì)胞中KIM-1蛋白和mRNA水平表達(dá)下調(diào) 干擾組+TGF-β1細(xì)胞中KIM-1蛋白和mRNA水平較對(duì)照組+TGF-β1顯著降低(P<0.05)。陰性組+TGF-β1細(xì)胞中KIM-1蛋白和mRNA水平與對(duì)照組+TGF-β1比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。KIM-1 siRNA成功下調(diào)了腎小管上皮細(xì)胞中KIM-1的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 Western印跡測(cè)定轉(zhuǎn)染KIM-1 siRNA后的腎小管上皮細(xì)胞中KIM-1蛋白表達(dá)

組別KIM-1 mRNAKIM-1蛋白對(duì)照組+TGF-β11.00±0.000.93±0.11陰性組+TGF-β10.98±0.130.95±0.14干擾組+TGF-β10.41±0.061)0.36±0.051)

與對(duì)照組+TGF-β1比較：1)P<0.05

2.3下調(diào)KIM-1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT 與對(duì)照組比較，對(duì)照組+TGF-β1細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，α-SMA蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與對(duì)照組+TGF-β1比較，干擾組+TGF-β1細(xì)胞中E-cadherin蛋白水平顯著升高，α-SMA蛋白水平顯著降低(P<0.05)。陰性組+TGF-β1細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA蛋白與對(duì)照組+TGF-β1比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT，而下調(diào)KIM-1可以減弱TGF-β1對(duì)腎小管上皮細(xì)胞EMT的誘導(dǎo)作用。見(jiàn)圖3、表3。

組別E-cadherinα-SMA對(duì)照組0.83±0.090.25±0.04對(duì)照組+TGF-β10.48±0.071)0.75±0.091)陰性組+TGF-β10.46±0.080.73±0.05干擾組+TGF-β10.67±0.072)0.60±0.052)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與對(duì)照組+TGF-β1比較：2)P<0.05，下表同

2.4下調(diào)KIM-1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)纖維化因子CTGF、Col1、Col3 與對(duì)照組比較，對(duì)照組+TGF-β1細(xì)胞中CTGF、Col1、Col3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與對(duì)照組+TGF-β1比較，干擾組+TGF-β1細(xì)胞中CTGF、Col1、Col3蛋白水平顯著降低(P<0.05)。陰性組+TGF-β1細(xì)胞中CTGF、Col1、Col3蛋白與對(duì)照組+TGF-β1比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)纖維化因子CTGF、Col1、Col3，而下調(diào)KIM-1可以減弱TGF-β1對(duì)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)CTGF、Col1、Col3的誘導(dǎo)作用。見(jiàn)表4、圖4。

圖4 Western印跡檢測(cè)下調(diào)KIM-1后的腎小管上皮細(xì)胞纖維化因子的表達(dá)

組別CTGFCol1Col3對(duì)照組0.35±0.030.25±0.020.12±0.03對(duì)照組+TGF-β10.69±0.051)0.52±0.061)0.28±0.021)陰性組+TGF-β10.68±0.090.53±0.080.29±0.04干擾組+TGF-β10.46±0.052)0.40±0.042)0.19±0.032)

3 討 論

KIM-1蛋白含有一個(gè)6個(gè)半胱氨酸構(gòu)成的球蛋白和黏液素的功能區(qū)域連接而成的結(jié)構(gòu)域，在正常的腎臟組織中表達(dá)水平極低，在損傷后的腎組織中異常升高〔7，8〕。KIM-1水平與患者腎組織損傷程度的診斷、預(yù)后等有關(guān)〔9〕。KIM-1可以誘導(dǎo)急性腎損傷大鼠腎小管上皮細(xì)胞發(fā)揮清除組織碎片的作用，而清除組織碎片有利于腎小管重構(gòu)，KIM-1是急性腎損傷發(fā)生后炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔10，11〕。同樣在慢性腎損傷中發(fā)現(xiàn)，KIM-1表達(dá)明顯的區(qū)域腎小管損傷嚴(yán)重，腎纖維化程度高，KIM-1與慢性腎臟疾病有關(guān)〔12，13〕。研究顯示，TGF-β1刺激后的腎小管上皮細(xì)胞中KIM-1表達(dá)水平升高，KIM-1可能參與腎小管上皮細(xì)胞纖維化的發(fā)生〔14〕。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，TGF-β1處理以后的腎小管上皮細(xì)胞中KIM-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平均升高，這與上述報(bào)道相符合。上皮細(xì)胞黏附在基底膜上，是一種極性細(xì)胞，其側(cè)面可以與鄰近的上皮細(xì)胞相互作用，形成類似于鋪路石樣的形態(tài)，而間充質(zhì)細(xì)胞可以分化為多種不同的間質(zhì)細(xì)胞，在胚胎的發(fā)育中具有重要作用〔15〕。EMT主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞形態(tài)特征減弱，逐漸與基底膜分離，并獲得間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志，在心肌纖維化、腎組織纖維化、癌癥轉(zhuǎn)移等疾病的發(fā)生中有重要作用〔16〕。腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生與腎組織的損傷有關(guān)，如腎小球腎炎、高血壓、糖尿病腎病等，研究表明，在不同原因引起的腎組織損傷中均發(fā)現(xiàn)有不同程度的腎小管EMT，并且EMT發(fā)生水平不僅與血肌酐水平等相關(guān)，還與腎纖維化的程度及預(yù)后有關(guān)〔17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1處理后的腎小管上皮細(xì)胞EMT水平升高，而敲低KIM-1可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT，提示KIM-1在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中具有重要作用。

腎組織纖維化與細(xì)胞分泌的多種纖維化因子的表達(dá)有關(guān)，CTGF是由349個(gè)氨基酸組成的多肽，屬于一種生長(zhǎng)因子，參與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞黏附、有絲分裂等過(guò)程，在腎纖維化中發(fā)揮促進(jìn)作用，在多種原因引起的腎損傷中表達(dá)上調(diào)〔18〕。Col1、Col3過(guò)度表達(dá)是腎纖維化發(fā)生的重要原因，其表達(dá)水平升高后可以促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞纖維化〔19〕。研究表明，TGF-β1作為一種重要的腎纖維化誘發(fā)因子，可以促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞中Col1、Col3、CTGF的表達(dá)〔20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低KIM-1可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)Col1、Col3、CTGF，敲低KIM-1具有抑制腎小管上皮細(xì)胞纖維化的作用。

KIM-1在腎纖維化中表達(dá)上調(diào)，在TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞纖維化中表達(dá)升高，敲低KIM-1的表達(dá)水平可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT和表達(dá)纖維化因子，KIM-1可能是一個(gè)潛在的干預(yù)腎間質(zhì)纖維化的靶點(diǎn)。