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        長鏈非編碼RNA MEG3通過抑制肺鱗癌干細(xì)胞特性增強(qiáng)平陽霉素敏感性的作用

        2019-03-01 08:24:00孔樹佳李硯文
        中國老年學(xué)雜志 2019年4期
        關(guān)鍵詞:平陽鱗癌抵抗

        孔樹佳 李硯文

        (昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 云南省腫瘤醫(yī)院,云南 昆明 650118)

        2015年我國新發(fā)肺癌病例73.3萬,死亡61.0萬〔1〕。肺癌組織學(xué)類型包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)及非小細(xì)胞肺癌(NSCLC),其中NSCLC占全部肺癌的80%,肺鱗癌占30%,是僅次于肺腺癌的病理類型〔2〕。平陽霉素是對鱗癌有效的抗腫瘤藥物,其與博萊霉素相比,有較低的毒性和更強(qiáng)的藥效〔3〕,研究顯示,腫瘤干細(xì)胞在腫瘤惡性進(jìn)展及放化療抵抗的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔4〕,長鏈非編碼RNA(LncRNA)母系表達(dá)基因(MEG)3可影響多種惡性腫瘤化療抵抗能力〔5,6〕,但其與平陽霉素抵抗形成的關(guān)系尚未有報(bào)道。本研究對平陽霉素抑制肺鱗癌細(xì)胞的能力及影響平陽霉素抵抗形成的因素進(jìn)行探究。

        1 材料與方法

        1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及培養(yǎng) 使用人肺鱗癌細(xì)胞系H520(美國模式培養(yǎng)物集存庫,ATCC),培養(yǎng)基:RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清(FBS,美國Hyclone),培養(yǎng)于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海恒字)中:5% CO2,37℃,飽和濕度,1∶2細(xì)胞傳代,于超凈工作臺(美國Thermo Fisher)中嚴(yán)格無菌操作。

        1.2細(xì)胞處理及分組 細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)外源性上調(diào)H520中MEG3的表達(dá):接種對數(shù)生長期的H520細(xì)胞于50 cm2培養(yǎng)瓶中,將細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及空白組,取2支1.5 ml離心管,加入500 μl無血清RPMI1640培養(yǎng)基,并分別加入4 μg 含MEG3全長序列的載體及4 μg空白載體(上海吉凱基因),室溫靜置5 min后加入10 μl 轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體lipofectamine 3000(美國Thermo Fisher)并充分混勻,室溫靜置20 min,無血清RPMI1640培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次,實(shí)驗(yàn)組加入含MEG3全長序列載體的混合液,空白組加入含空白載體的混合液,7 h后RPMI1640培養(yǎng)基+10% FBS 繼續(xù)培養(yǎng)48 h,得到實(shí)驗(yàn)組及空白組細(xì)胞。遞增濃度梯度法建立平陽霉素(吉林敖東藥業(yè))抵抗的H520細(xì)胞系:分別以1、2、4、8、16、32、64 μg/ml濃度誘導(dǎo)H520細(xì)胞,每個誘導(dǎo)濃度維持細(xì)胞穩(wěn)定生長1 w,誘導(dǎo)期間每2 d更換新的平陽霉素與RPMI-1640培養(yǎng)基+10%FBS混合液,篩選至細(xì)胞于64 μg/ml濃度中可穩(wěn)定生長,作為抵抗組,未處理的H520細(xì)胞作為對照組。

        1.3熒光定量(RT-q)PCR技術(shù)檢測細(xì)胞MEG3表達(dá) 抵抗組及對照組細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)組及空白組細(xì)胞于轉(zhuǎn)染完成后48 h采用TRIzol(日本Takara)抽提總RNA,超微量分光光度計(jì)(美國Molecular Devices)檢測RNA濃度,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara)對1 μg RNA行逆轉(zhuǎn)錄,得到相應(yīng)的cDNA模板,無核酶水(美國Thermo Fisher)稀釋至100 nmol/(L·ml),每個上樣孔按10 μmol/L上游引物及下游引物(由上海生工生物工程公司合成)、5 μl cDNA模板及10 μl SYBR Green熒光染料體系進(jìn)行上樣,引物序列:MEG3:正義鏈5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′,反義鏈5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′,3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH):正義鏈5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′,反義鏈5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems)檢測MEG3及GAPDH熒光強(qiáng)度,以GAPDH為內(nèi)參基因,2-△△CT法計(jì)算MEG3的表達(dá)量。

        1.4Western印跡法檢測細(xì)胞八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(Oct)-4及性別決定區(qū)Y框蛋白(Sox)-2表達(dá)水平 收集50 cm2培養(yǎng)瓶中的各組細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)>1×106個,RIPA裂解液(上海生工生物工程公司)重懸細(xì)胞,冰上裂解細(xì)胞2 h,離心機(jī)(德國Eppendorf 5417r),4℃,離心10 min,取細(xì)胞上清液,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(上海生工生物工程公司)檢測總蛋白濃度,30 μg行10%聚丙烯凝膠電泳,100 V電壓轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore),脫脂牛奶封閉1 h,1∶1 000 Oct-4(美國Abcam,ab18976)孵育45 KDa條帶,1∶1 000 Sox-2(美國Abcam,ab92494)孵育34 KDa條帶,1∶1 000 GAPDH(美國Abcam,ab181603)孵育37 KDa條帶,室溫孵育3 h,1∶2 000羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(美國Abcam,ab6721)孵育各條帶1 h,電化學(xué)發(fā)光(ECL)底物(美國Thermo Pierce)孵育條帶1 min,ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)曝光顯影,以相對灰度值表示蛋白表達(dá)水平。

        1.5細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞平陽霉素半抑制濃度(IC50) 將各組細(xì)胞接種至96孔板,濃度2×103個/孔,設(shè)置0、5、10、20、40、80 μg/ml濃度梯度,每組設(shè)置5個平行樣本,12 h后以含相應(yīng)濃度平陽霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基+10%FBS混合液替換原有培養(yǎng)基,處理24 h后,CCK-8試劑(日本同仁化學(xué))與RPMI-1640培養(yǎng)基+10%FBS 1∶8混合液替換含平陽霉素的培養(yǎng)基,生化培養(yǎng)箱中孵育1 h,酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices)檢測各樣本450 nm處吸光度(OD)值,OD值表示細(xì)胞活力。

        1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS17.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、回歸分析。

        2 結(jié) 果

        2.1各組細(xì)胞MEG3、Oct-4及Sox-2表達(dá)水平比較 實(shí)驗(yàn)組MEG3表達(dá)水平顯著高于空白組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.837,P<0.01);抵抗組MEG3表達(dá)水平顯著低于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.513,P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組Oct-4表達(dá)水平顯著低于空白組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.597,P<0.05);抵抗組Oct-4表達(dá)水平顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.846,P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組Sox-2表達(dá)水平顯著低于空白組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.892,P<0.01);抵抗組Sox-2表達(dá)水平顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.604,P<0.01),見表1。

        表1 各組細(xì)胞MEG3、Oct-4及Sox-2表達(dá)水平比較

        與空白組比較:1)P<0.05,2)P<0.01;與對照組比較:3)P<0.05,4)P<0.01

        2.2各組細(xì)胞平陽霉素IC50的比較 實(shí)驗(yàn)組平陽霉素IC50顯著低于空白組〔(8.21±1.48)μg/ml vs (13.39±2.02)μg/ml〕,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.994,P<0.01),見圖1;抵抗組平陽霉素IC50顯著高于對照組〔(32.50±7.26)μg/ml vs (12.67±3.61)μg/ml〕,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.238,P<0.001),見圖2。

        圖1 實(shí)驗(yàn)組與空白組平陽霉素IC50值的比較

        圖2 抵抗組與對照組平陽霉素IC50值的比較

        3 討 論

        平陽霉素對多數(shù)鱗癌細(xì)胞均具有較佳的療效,目前作為口腔鱗癌及舌鱗癌的一線用藥廣泛應(yīng)用〔7,8〕,但其對于肺鱗癌的療效鮮有報(bào)道。LncRNA是一類長度大于200 nt的非編碼RNA,其不編碼蛋白,直接通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾等機(jī)制發(fā)揮生物學(xué)作用〔9〕,MEG3作為其中的一員被發(fā)現(xiàn)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其可抑制胃癌、前列腺癌、膀胱癌及NSCLC等多種惡性腫瘤細(xì)胞〔10~13〕,且影響腫瘤細(xì)胞化療抵抗的形成:Li等〔5〕研究顯示,MEG3可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡顯著提高結(jié)直腸癌細(xì)胞奧沙利鉑的敏感性;Liu等〔6〕研究發(fā)現(xiàn),MEG3在順鉑抵抗的NSCLC組織及細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),在順鉑抵抗的NSCLC細(xì)胞中外源性上調(diào)MEG3后,細(xì)胞順鉑敏感性恢復(fù),表明MEG3對NSCLC順鉑敏感性存在促進(jìn)作用;Zhou等〔14〕研究顯示,MEG3在伊馬替尼耐藥的慢性粒細(xì)胞白血病患者中表達(dá)顯著下降,伊馬替尼抵抗的K562細(xì)胞中表達(dá)同樣顯著降低,過表達(dá)MEG3后,伊馬替尼抵抗的K562細(xì)胞增殖能力顯著下降,細(xì)胞凋亡增加,且伊馬替尼敏感性增強(qiáng);同時(shí)MEG3還可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性〔15,16〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,平陽霉素可有效抑制肺鱗癌的細(xì)胞活力,是有效的抗肺鱗癌藥物,在野生型肺鱗癌細(xì)胞H520中外源性上調(diào)MEG3可顯著增強(qiáng)H520細(xì)胞平陽霉素的敏感性,且H520平陽霉素抵抗細(xì)胞株MEG3的表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào),提示MEG3對肺鱗癌細(xì)胞平陽霉素敏感性存在重要促進(jìn)作用。腫瘤干細(xì)胞是控制腫瘤惡性行為的關(guān)鍵因素,包括腫瘤細(xì)胞的無限增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及放化療抵抗,Oct-4及Sox-2是干細(xì)胞特征性標(biāo)志物,兩者相互作用,共同維持腫瘤的干細(xì)胞特性〔17〕。Balci等〔18〕研究指出MEG3在腦腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào),由此推測MEG3可能影響肺鱗癌干細(xì)胞特性,進(jìn)而調(diào)控其對平陽霉素的敏感性,本研究顯示,上調(diào)MEG3后H520細(xì)胞Oct-4及Sox-2均顯著下調(diào),在平陽霉素抵抗細(xì)胞系中Oct-4及Sox-2顯著上調(diào),提示腫瘤干細(xì)胞與平陽霉素抵抗的形成密切相關(guān),且MEG3可通過抑制肺鱗癌干細(xì)胞特性,增強(qiáng)其對平陽霉素的敏感性。

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