孔樹佳 李硯文

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 云南省腫瘤醫(yī)院，云南 昆明 650118)

2015年我國(guó)新發(fā)肺癌病例73.3萬(wàn)，死亡61.0萬(wàn)〔1〕。肺癌組織學(xué)類型包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)及非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC占全部肺癌的80%，肺鱗癌占30%，是僅次于肺腺癌的病理類型〔2〕。平陽(yáng)霉素是對(duì)鱗癌有效的抗腫瘤藥物，其與博萊霉素相比，有較低的毒性和更強(qiáng)的藥效〔3〕，研究顯示，腫瘤干細(xì)胞在腫瘤惡性進(jìn)展及放化療抵抗的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔4〕，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)母系表達(dá)基因(MEG)3可影響多種惡性腫瘤化療抵抗能力〔5,6〕，但其與平陽(yáng)霉素抵抗形成的關(guān)系尚未有報(bào)道。本研究對(duì)平陽(yáng)霉素抑制肺鱗癌細(xì)胞的能力及影響平陽(yáng)霉素抵抗形成的因素進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及培養(yǎng) 使用人肺鱗癌細(xì)胞系H520(美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，ATCC)，培養(yǎng)基：RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清(FBS，美國(guó)Hyclone)，培養(yǎng)于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海恒字)中：5% CO2，37℃，飽和濕度，1∶2細(xì)胞傳代，于超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo Fisher)中嚴(yán)格無(wú)菌操作。

1.2細(xì)胞處理及分組 細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)外源性上調(diào)H520中MEG3的表達(dá)：接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H520細(xì)胞于50 cm2培養(yǎng)瓶中，將細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及空白組，取2支1.5 ml離心管，加入500 μl無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，并分別加入4 μg 含MEG3全長(zhǎng)序列的載體及4 μg空白載體(上海吉?jiǎng)P基因)，室溫靜置5 min后加入10 μl 轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體lipofectamine 3000(美國(guó)Thermo Fisher)并充分混勻，室溫靜置20 min，無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次，實(shí)驗(yàn)組加入含MEG3全長(zhǎng)序列載體的混合液，空白組加入含空白載體的混合液，7 h后RPMI1640培養(yǎng)基+10% FBS 繼續(xù)培養(yǎng)48 h，得到實(shí)驗(yàn)組及空白組細(xì)胞。遞增濃度梯度法建立平陽(yáng)霉素(吉林敖東藥業(yè))抵抗的H520細(xì)胞系：分別以1、2、4、8、16、32、64 μg/ml濃度誘導(dǎo)H520細(xì)胞，每個(gè)誘導(dǎo)濃度維持細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)1 w，誘導(dǎo)期間每2 d更換新的平陽(yáng)霉素與RPMI-1640培養(yǎng)基+10%FBS混合液，篩選至細(xì)胞于64 μg/ml濃度中可穩(wěn)定生長(zhǎng)，作為抵抗組，未處理的H520細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.3熒光定量(RT-q)PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞MEG3表達(dá) 抵抗組及對(duì)照組細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)組及空白組細(xì)胞于轉(zhuǎn)染完成后48 h采用TRIzol(日本Takara)抽提總RNA，超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Molecular Devices)檢測(cè)RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara)對(duì)1 μg RNA行逆轉(zhuǎn)錄，得到相應(yīng)的cDNA模板，無(wú)核酶水(美國(guó)Thermo Fisher)稀釋至100 nmol/(L·ml)，每個(gè)上樣孔按10 μmol/L上游引物及下游引物(由上海生工生物工程公司合成)、5 μl cDNA模板及10 μl SYBR Green熒光染料體系進(jìn)行上樣，引物序列：MEG3：正義鏈5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，反義鏈5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：正義鏈5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反義鏈5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems)檢測(cè)MEG3及GAPDH熒光強(qiáng)度，以GAPDH為內(nèi)參基因，2-△△CT法計(jì)算MEG3的表達(dá)量。

1.4Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(Oct)-4及性別決定區(qū)Y框蛋白(Sox)-2表達(dá)水平 收集50 cm2培養(yǎng)瓶中的各組細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)>1×106個(gè)，RIPA裂解液(上海生工生物工程公司)重懸細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞2 h，離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 5417r)，4℃，離心10 min，取細(xì)胞上清液，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(上海生工生物工程公司)檢測(cè)總蛋白濃度，30 μg行10%聚丙烯凝膠電泳，100 V電壓轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)Millipore)，脫脂牛奶封閉1 h，1∶1 000 Oct-4(美國(guó)Abcam，ab18976)孵育45 KDa條帶，1∶1 000 Sox-2(美國(guó)Abcam，ab92494)孵育34 KDa條帶，1∶1 000 GAPDH(美國(guó)Abcam，ab181603)孵育37 KDa條帶，室溫孵育3 h，1∶2 000羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(美國(guó)Abcam，ab6721)孵育各條帶1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)底物(美國(guó)Thermo Pierce)孵育條帶1 min，ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)曝光顯影，以相對(duì)灰度值表示蛋白表達(dá)水平。

1.5細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞平陽(yáng)霉素半抑制濃度(IC50) 將各組細(xì)胞接種至96孔板，濃度2×103個(gè)/孔，設(shè)置0、5、10、20、40、80 μg/ml濃度梯度，每組設(shè)置5個(gè)平行樣本，12 h后以含相應(yīng)濃度平陽(yáng)霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基+10%FBS混合液替換原有培養(yǎng)基，處理24 h后，CCK-8試劑(日本同仁化學(xué))與RPMI-1640培養(yǎng)基+10%FBS 1∶8混合液替換含平陽(yáng)霉素的培養(yǎng)基，生化培養(yǎng)箱中孵育1 h，酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices)檢測(cè)各樣本450 nm處吸光度(OD)值，OD值表示細(xì)胞活力。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS17.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞MEG3、Oct-4及Sox-2表達(dá)水平比較 實(shí)驗(yàn)組MEG3表達(dá)水平顯著高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.837，P<0.01)；抵抗組MEG3表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.513，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組Oct-4表達(dá)水平顯著低于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.597，P<0.05)；抵抗組Oct-4表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.846，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組Sox-2表達(dá)水平顯著低于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.892，P<0.01)；抵抗組Sox-2表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.604，P<0.01)，見表1。

表1 各組細(xì)胞MEG3、Oct-4及Sox-2表達(dá)水平比較

與空白組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與對(duì)照組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

2.2各組細(xì)胞平陽(yáng)霉素IC50的比較 實(shí)驗(yàn)組平陽(yáng)霉素IC50顯著低于空白組〔(8.21±1.48)μg/ml vs (13.39±2.02)μg/ml〕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.994，P<0.01)，見圖1；抵抗組平陽(yáng)霉素IC50顯著高于對(duì)照組〔(32.50±7.26)μg/ml vs (12.67±3.61)μg/ml〕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.238，P<0.001)，見圖2。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與空白組平陽(yáng)霉素IC50值的比較

圖2 抵抗組與對(duì)照組平陽(yáng)霉素IC50值的比較

3 討 論

平陽(yáng)霉素對(duì)多數(shù)鱗癌細(xì)胞均具有較佳的療效，目前作為口腔鱗癌及舌鱗癌的一線用藥廣泛應(yīng)用〔7,8〕，但其對(duì)于肺鱗癌的療效鮮有報(bào)道。LncRNA是一類長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA，其不編碼蛋白，直接通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾等機(jī)制發(fā)揮生物學(xué)作用〔9〕，MEG3作為其中的一員被發(fā)現(xiàn)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可抑制胃癌、前列腺癌、膀胱癌及NSCLC等多種惡性腫瘤細(xì)胞〔10～13〕，且影響腫瘤細(xì)胞化療抵抗的形成：Li等〔5〕研究顯示，MEG3可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡顯著提高結(jié)直腸癌細(xì)胞奧沙利鉑的敏感性；Liu等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，MEG3在順鉑抵抗的NSCLC組織及細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，在順鉑抵抗的NSCLC細(xì)胞中外源性上調(diào)MEG3后，細(xì)胞順鉑敏感性恢復(fù)，表明MEG3對(duì)NSCLC順鉑敏感性存在促進(jìn)作用；Zhou等〔14〕研究顯示，MEG3在伊馬替尼耐藥的慢性粒細(xì)胞白血病患者中表達(dá)顯著下降，伊馬替尼抵抗的K562細(xì)胞中表達(dá)同樣顯著降低，過表達(dá)MEG3后，伊馬替尼抵抗的K562細(xì)胞增殖能力顯著下降，細(xì)胞凋亡增加，且伊馬替尼敏感性增強(qiáng)；同時(shí)MEG3還可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性〔15,16〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，平陽(yáng)霉素可有效抑制肺鱗癌的細(xì)胞活力，是有效的抗肺鱗癌藥物，在野生型肺鱗癌細(xì)胞H520中外源性上調(diào)MEG3可顯著增強(qiáng)H520細(xì)胞平陽(yáng)霉素的敏感性，且H520平陽(yáng)霉素抵抗細(xì)胞株MEG3的表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)，提示MEG3對(duì)肺鱗癌細(xì)胞平陽(yáng)霉素敏感性存在重要促進(jìn)作用。腫瘤干細(xì)胞是控制腫瘤惡性行為的關(guān)鍵因素，包括腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及放化療抵抗，Oct-4及Sox-2是干細(xì)胞特征性標(biāo)志物，兩者相互作用，共同維持腫瘤的干細(xì)胞特性〔17〕。Balci等〔18〕研究指出MEG3在腦腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，由此推測(cè)MEG3可能影響肺鱗癌干細(xì)胞特性，進(jìn)而調(diào)控其對(duì)平陽(yáng)霉素的敏感性，本研究顯示，上調(diào)MEG3后H520細(xì)胞Oct-4及Sox-2均顯著下調(diào)，在平陽(yáng)霉素抵抗細(xì)胞系中Oct-4及Sox-2顯著上調(diào)，提示腫瘤干細(xì)胞與平陽(yáng)霉素抵抗的形成密切相關(guān)，且MEG3可通過抑制肺鱗癌干細(xì)胞特性，增強(qiáng)其對(duì)平陽(yáng)霉素的敏感性。