常琦 阮貞 王憲偉 王茂朋

(1三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院急診科，湖北 宜昌 443001；2宜昌市中心醫(yī)院心內(nèi)科；3三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院骨科)

前列腺素和甲狀旁腺激素可刺激骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨下骨的成骨細(xì)胞合成環(huán)磷酸腺苷的能力下降，而其均在OA中發(fā)揮相應(yīng)作用，說明成骨細(xì)胞功能缺陷與OA軟骨下骨重塑相關(guān)〔1〕。研究表明，一系列相關(guān)因子對成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞活性均有調(diào)節(jié)作用，已經(jīng)明確骨保護(hù)素(OPG)、核因子κB受體活化因子(RANK)和RANK配體(L)在調(diào)節(jié)軟骨下骨的重塑中起著重要的作用〔2〕。交感系統(tǒng)調(diào)控著骨代謝，目前已比較明確的在骨組織中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)有降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、P物質(zhì)(SP)、血管活性腸肽(VIP)、神經(jīng)肽(NP)Y等，這些神經(jīng)因子在骨的生長發(fā)育等過程中起著重要的作用，CGRP、神經(jīng)生長因子(NGF)能促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟，加速骨折愈合，另外研究也顯示這些神經(jīng)因子參與股骨頭壞死疾病的進(jìn)展〔3，4〕。本實驗觀察OA大鼠造模后不同時期軟骨下骨CGRP、NGF的改變，并測定其相應(yīng)時期血清OPG濃度的改變，以更好地了解OA軟骨下骨骨代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物和主要試劑 SPF 級雄性 SD 大鼠(購自三峽大學(xué)實驗動物中心) 40 只，5月齡，體重 260～290 g，飼養(yǎng)于三峽大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境達(dá)到動物實驗條件要求。隨機(jī)分為4組，分別為對照組，實驗組(2 w組，4 w組，8 w組)，每組10只，對照組為假手術(shù)，2 w組、4 w組和8 w組為造模2、4、8 w后處死組。OPG酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒和NGF 兔抗鼠單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；CGRP 兔抗鼠單克隆抗體 (北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；生物素化羊抗兔二抗試劑盒(天津 TBD 生物工程有限公司)；青霉素粉劑(華北制藥股份有限公司)；其他實驗常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2大鼠OA模型的制備 采用大鼠前交叉韌帶切斷方法造模，1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射，麻醉完成后，備皮，常規(guī)右后膝消毒鋪巾后，行膝髕旁內(nèi)側(cè)切口，切開皮膚，仔細(xì)分離皮下組織，將髕骨向外側(cè)脫位，切開關(guān)節(jié)囊，顯露膝關(guān)節(jié)，屈曲膝關(guān)節(jié)，可見膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶，以剪刀剪斷，行前抽屜實驗(+)，證明實驗切斷前交叉成功，生理鹽水反復(fù)沖洗傷口，以4-0愛惜康帶針線縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚，活力碘消毒，術(shù)后第一天肌注青霉素20萬U，并傷口活力碘消毒。對照組造模方法同前，顯露膝關(guān)節(jié)，屈曲見膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶連續(xù)性完整，前交叉實驗，生理鹽水反復(fù)沖洗膝關(guān)節(jié)，以4-0愛惜康帶針線縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚，術(shù)后第一天肌注青霉素20萬U，并傷口活力碘消毒。

1.3大鼠血清OPG測定 腹腔麻醉完成后，胸部剪毛備皮，常規(guī)活力碘消毒，鋪無菌巾，沿胸骨左緣切開皮膚，剪斷肋骨，顯露心臟，用靜脈采血針插入左心室，抽取約3 ml血液，放入低溫(4℃)冰箱靜置，30 min后離心機(jī)離心(3 000 r/min)，再放入-80℃冰箱保存，待所有血清標(biāo)本收集后，常溫下復(fù)融，按照OPG ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，經(jīng)酶標(biāo)儀在450 nm光度值下測定其OD值，繪出標(biāo)準(zhǔn)線性方程，根據(jù)相應(yīng)結(jié)果測出OPG濃度。

1.4大鼠軟骨下骨CGRP、NGF免疫組化切片制作 大鼠心臟取血完成后，立即沿右后膝原來手術(shù)切口切開皮膚，分離皮下筋膜組織，髕骨外翻，切開關(guān)節(jié)囊，顯露膝關(guān)節(jié)，肉眼觀察膝關(guān)節(jié)軟骨退變大體情況，取脛骨內(nèi)側(cè)髁，完整剔除周圍肌肉筋膜等軟組織，置于4%多聚甲醛溶液下，4℃冰箱固定24 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分浸洗，沖洗2 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣4 w，修整組織塊，石蠟包埋處理，作冠狀面不連續(xù)切片，每個標(biāo)本切9張，間隔100 μm切片，各取3張分別行HE，NGF和CGRP免疫組化染色。肉眼觀察大鼠膝關(guān)節(jié)大體情況，顯微鏡下觀察HE染色，并對軟骨進(jìn)行Mankin評分，采用ImageProPlus5.0.2圖像分析系統(tǒng)軟件分析CGRP、SP免疫組化染色切片，置于40倍物鏡下取軟骨表層至鈣化層為觀察范圍，每個標(biāo)本隨機(jī)選3個視野，測定其灰度值。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1實驗動物一般情況 動物術(shù)后均未發(fā)生傷口感染，早期大鼠活動減少，跛行，1 w后基本恢復(fù)正?；顒?，未發(fā)生死亡情況。

2.2HE染色細(xì)胞形態(tài)學(xué) 對照組關(guān)節(jié)軟骨的層次結(jié)構(gòu)清晰，軟骨表面無破壞，保持其完整性；2 w組關(guān)節(jié)軟骨表層軟骨細(xì)胞發(fā)生改變，可見細(xì)胞聚集現(xiàn)象，于軟骨表層及中間層交界處，可見不規(guī)則軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞呈巢狀，排列紊亂，軟骨細(xì)胞大小、密度不均一；4 w組軟骨細(xì)胞數(shù)量變少，排列更加紊亂，可見軟骨表明毛糙；8 w組上述改變更加嚴(yán)重，部分區(qū)域軟骨細(xì)胞缺損(圖1)。2 w組〔(3.82±0.48)分〕，4 w組〔(5.24±0.92)分〕，8 w組Mankin評分〔(7.14±0.31)分〕明顯高于對照組〔(0.58±0.53)分〕，表明建模成功，各組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=25.3，P<0.01)。

圖1 各組軟骨細(xì)胞HE染色(×40)

2.3血清 OPG 結(jié)果 與對照組(290.7±10.4)相比，2 w組(263.6±8.2)及4 w組血清OPG濃度(178.5±7.5)逐漸下降，8 w組(240.9±6.3)又稍回升，各組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=29.3，P<0.01)。

2.4CGRP、NGF免疫組化染色切片結(jié)果 CGRP、NGF免疫組化染色，兩組變化趨勢相一致，對照組骨小梁區(qū)周圍著色區(qū)域多，著色較深；2 w組骨小梁著色區(qū)域變淡；4 w組相應(yīng)著色更少，8 w組較前顏色稍加深，見圖2、圖3。灰度值結(jié)果見表1，CGRP各組間比較存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，NGF各組間比較存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。

圖2 各組CGRP免疫組化切片(×100)

圖3 各組NGF免疫組化切片(×100)

組別CGRPNGF對照組190.2±8.3110.6±4.52 w組171.2±6.892.6±5.14 w組113.5±8.663.0±7.38 w組145.7±6.977.2±4.8F/P值22.8/<0.0125.8/<0.01

3 討 論

OA是最常見的一種關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)生是由于各種因素導(dǎo)致生物力學(xué)特性改變，致使關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨及細(xì)胞外基質(zhì)失衡。長期以來，軟骨退變一直是國內(nèi)外比較關(guān)注的重點，對于軟骨下骨的作用研究較少，近些年來發(fā)現(xiàn)軟骨下骨改變是OA的重要病理變化，盡管對于其是否是OA始發(fā)因素尚存在爭論。許多基礎(chǔ)實驗證明，OA時軟骨下骨重塑所導(dǎo)致的骨質(zhì)硬化，骨密度增高，使軟骨下骨的生物學(xué)性能改變，其對關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)功能下降，進(jìn)而引起或者加重關(guān)節(jié)軟骨退變〔5〕。

OPG、RANKL、RANK是目前公認(rèn)的調(diào)控骨代謝的重要途徑，其為腫瘤壞死因子家族成員，通過作用于破骨細(xì)胞，調(diào)控著骨形成及骨吸收。RANK與RANKL結(jié)合后，可通過核因子途徑激活破骨細(xì)胞分化的信號傳導(dǎo)通路，誘發(fā)相應(yīng)激酶，發(fā)生一系列酶鏈反應(yīng)，激活核因子復(fù)合體、活化蛋白-1及轉(zhuǎn)錄因子，核因子再次激活破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的核因子復(fù)合體，通過一系列反應(yīng)，使沒有功能的破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化成有活性的破骨細(xì)胞。最近研究發(fā)現(xiàn)，OPG/RANK/RANKL不僅在軟骨下骨中表達(dá)，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，軟骨本身也能產(chǎn)生OPG、RANK、RANKL，OPG通過相應(yīng)途徑調(diào)控軟骨代謝，在OA疾病進(jìn)展中發(fā)揮著不可忽略的作用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)〔7〕，通過實時定量PCR進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，OA組和正常組均有上述因子產(chǎn)生，軟骨細(xì)胞OPG的含量較RANK與RANKL高，OA患者RANK含量明顯較正常組增高。OA軟骨產(chǎn)生并分泌OPG，在OA軟骨細(xì)胞表面，也可以發(fā)現(xiàn)RANK及RANKL，有趣的是，盡管膜性RANKL在所有軟骨細(xì)胞均可發(fā)現(xiàn)，膜性RANK僅在軟骨細(xì)胞某些亞群產(chǎn)生，僅有(29±4)%的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生RANK，這些軟骨細(xì)胞分布在整個軟骨層，進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)RANK的軟骨細(xì)胞其軟骨細(xì)胞標(biāo)志物如蛋白聚糖，膠原酶-Ⅱ含量明顯增高。本實驗通過測量血清OPG含量，從側(cè)面間接反映大鼠OA時期軟骨代謝的改變，發(fā)現(xiàn)早期OPG含量一直下降，8 w后又稍上升，這些與上述結(jié)果符合，也與文獻(xiàn)報道的其他實驗結(jié)果類似〔8〕，這些均說明OPG在OA疾病進(jìn)展中發(fā)揮著不可忽略的作用。OA早期，骨吸收為主要改變，OPG的抑制破骨細(xì)胞功能下降，破骨細(xì)胞功能加強(qiáng)，導(dǎo)致軟骨下骨皮質(zhì)終板及骨小梁稀疏變薄，最終骨小梁失去彈性；后期，OPG含量逐漸增高，促進(jìn)成骨細(xì)胞功能加強(qiáng)，關(guān)節(jié)形成骨贅，代償關(guān)節(jié)改變。提示OA軟骨下骨骨代謝不單純是骨吸收過程，其是骨吸收與骨形成共同作用，軟骨下骨較高的骨轉(zhuǎn)化率是其重要的特點。

正常骨組織代謝離不開神經(jīng)系統(tǒng)有效的調(diào)控，骨組織中含有較多的神經(jīng)分泌的NP類物質(zhì)，如CGRP、SP、VIP、NPY等，這些物質(zhì)的受體均在骨組織中表達(dá)，許多在體實驗研究發(fā)現(xiàn)，這些肽類物質(zhì)調(diào)控著骨的代謝，影響骨細(xì)胞的生物學(xué)功能〔8〕。交感神經(jīng)、感覺神經(jīng)在骨小梁附近血管周圍交織成稠密的網(wǎng)織結(jié)構(gòu)。實驗及臨床研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)在骨的形成、生長、轉(zhuǎn)化及修復(fù)過程中具有很關(guān)鍵的作用〔9〕，這些神經(jīng)元細(xì)胞在外周的生長與生存又需要外周信號的引導(dǎo)，在骨組織中承擔(dān)這一角色的是NGF，總而言之，正常骨代謝需要交感神經(jīng)系統(tǒng)、感覺神經(jīng)系統(tǒng)及骨組織內(nèi)相應(yīng)細(xì)胞的共同作用。本實驗結(jié)果說明在早期軟骨下骨骨吸收為主，而CGRP對骨組織主要的生理學(xué)作用為促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨作用，其通過促進(jìn)成骨細(xì)胞環(huán)腺苷酸(c-AMP)形成，提高成骨活性，并刺激成骨細(xì)胞來源細(xì)胞增殖、分化。更深入研究〔10〕發(fā)現(xiàn)CGRP可增加胰島素樣生長因子(IGF)-1 mRNA的表達(dá)，使IGF-1合成增加，從而促進(jìn)骨形成。CGRP尚具有抑制破骨細(xì)胞的功能，使骨吸收能力下降，降低血中鈣含量。骨折時，CGRP含量明顯上升，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，促進(jìn)骨折的愈合。體外研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，CGRP可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成。有研究表明〔12〕，CGRP還可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生來促進(jìn)骨的血管化，而血管化又與軟骨下骨骨髓組織纖維化及OA疼痛相關(guān)。軟骨下骨骨髓組織纖維化與NGF的關(guān)系也很密切，其能誘使神經(jīng)纖維長入骨組織中，加重OA疼痛癥狀。NGF能誘使血管及神經(jīng)組織生成，有研究發(fā)現(xiàn)NGF受體可在成骨細(xì)胞上表達(dá)，NGF與之結(jié)合后，增強(qiáng)其成骨能力〔13〕。近期研究顯示，NGF在介導(dǎo)OA滑膜血管生成及疼痛方面有重要作用〔14〕，神經(jīng)因子，特別是NGF在OA關(guān)節(jié)滑液及滑膜炎患者滑膜組織中表達(dá)，另一實驗證明人類軟骨細(xì)胞能合成NGF并在其表面表達(dá)高親和性NGF受體，在OA病程中，軟骨細(xì)胞NGF及其受體表達(dá)上調(diào)，表明NGF在OA病程中能促進(jìn)軟骨細(xì)胞代謝〔15〕。

綜上，軟骨下骨在OA中的作用是當(dāng)前研究的熱點，通過藥物作用于軟骨下骨，改善其代謝，維持其生物力學(xué)特性，或許是OA藥物治療的一個新的方向。采用前交叉韌帶切斷方法可成功制造大鼠OA模型，該實驗方法簡單，成功率高；血清OPG、軟骨下骨CGRP、NGF作為調(diào)節(jié)骨代謝因子，調(diào)控著OA軟骨下骨骨代謝，是OA疾病發(fā)生的重要因子；通過藥物調(diào)節(jié)軟骨下骨骨代謝有希望達(dá)到治療OA的目的。