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        骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清骨保護(hù)素及軟骨下骨降鈣素基因相關(guān)肽、神經(jīng)生長因子表達(dá)及Mankin評(píng)分變化

        2019-03-01 08:15:34常琦阮貞王憲偉王茂朋
        中國老年學(xué)雜志 2019年4期
        關(guān)鍵詞:下骨骨細(xì)胞成骨細(xì)胞

        常琦 阮貞 王憲偉 王茂朋

        (1三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院急診科,湖北 宜昌 443001;2宜昌市中心醫(yī)院心內(nèi)科;3三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院骨科)

        前列腺素和甲狀旁腺激素可刺激骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨下骨的成骨細(xì)胞合成環(huán)磷酸腺苷的能力下降,而其均在OA中發(fā)揮相應(yīng)作用,說明成骨細(xì)胞功能缺陷與OA軟骨下骨重塑相關(guān)〔1〕。研究表明,一系列相關(guān)因子對(duì)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞活性均有調(diào)節(jié)作用,已經(jīng)明確骨保護(hù)素(OPG)、核因子κB受體活化因子(RANK)和RANK配體(L)在調(diào)節(jié)軟骨下骨的重塑中起著重要的作用〔2〕。交感系統(tǒng)調(diào)控著骨代謝,目前已比較明確的在骨組織中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)有降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、P物質(zhì)(SP)、血管活性腸肽(VIP)、神經(jīng)肽(NP)Y等,這些神經(jīng)因子在骨的生長發(fā)育等過程中起著重要的作用,CGRP、神經(jīng)生長因子(NGF)能促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟,加速骨折愈合,另外研究也顯示這些神經(jīng)因子參與股骨頭壞死疾病的進(jìn)展〔3,4〕。本實(shí)驗(yàn)觀察OA大鼠造模后不同時(shí)期軟骨下骨CGRP、NGF的改變,并測定其相應(yīng)時(shí)期血清OPG濃度的改變,以更好地了解OA軟骨下骨骨代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠(購自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心) 40 只,5月齡,體重 260~290 g,飼養(yǎng)于三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)環(huán)境達(dá)到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件要求。隨機(jī)分為4組,分別為對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組(2 w組,4 w組,8 w組),每組10只,對(duì)照組為假手術(shù),2 w組、4 w組和8 w組為造模2、4、8 w后處死組。OPG酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒和NGF 兔抗鼠單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);CGRP 兔抗鼠單克隆抗體 (北京博奧森生物技術(shù)有限公司);生物素化羊抗兔二抗試劑盒(天津 TBD 生物工程有限公司);青霉素粉劑(華北制藥股份有限公司);其他實(shí)驗(yàn)常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2大鼠OA模型的制備 采用大鼠前交叉韌帶切斷方法造模,1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射,麻醉完成后,備皮,常規(guī)右后膝消毒鋪巾后,行膝髕旁內(nèi)側(cè)切口,切開皮膚,仔細(xì)分離皮下組織,將髕骨向外側(cè)脫位,切開關(guān)節(jié)囊,顯露膝關(guān)節(jié),屈曲膝關(guān)節(jié),可見膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶,以剪刀剪斷,行前抽屜實(shí)驗(yàn)(+),證明實(shí)驗(yàn)切斷前交叉成功,生理鹽水反復(fù)沖洗傷口,以4-0愛惜康帶針線縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚,活力碘消毒,術(shù)后第一天肌注青霉素20萬U,并傷口活力碘消毒。對(duì)照組造模方法同前,顯露膝關(guān)節(jié),屈曲見膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶連續(xù)性完整,前交叉實(shí)驗(yàn),生理鹽水反復(fù)沖洗膝關(guān)節(jié),以4-0愛惜康帶針線縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚,術(shù)后第一天肌注青霉素20萬U,并傷口活力碘消毒。

        1.3大鼠血清OPG測定 腹腔麻醉完成后,胸部剪毛備皮,常規(guī)活力碘消毒,鋪無菌巾,沿胸骨左緣切開皮膚,剪斷肋骨,顯露心臟,用靜脈采血針插入左心室,抽取約3 ml血液,放入低溫(4℃)冰箱靜置,30 min后離心機(jī)離心(3 000 r/min),再放入-80℃冰箱保存,待所有血清標(biāo)本收集后,常溫下復(fù)融,按照OPG ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,經(jīng)酶標(biāo)儀在450 nm光度值下測定其OD值,繪出標(biāo)準(zhǔn)線性方程,根據(jù)相應(yīng)結(jié)果測出OPG濃度。

        1.4大鼠軟骨下骨CGRP、NGF免疫組化切片制作 大鼠心臟取血完成后,立即沿右后膝原來手術(shù)切口切開皮膚,分離皮下筋膜組織,髕骨外翻,切開關(guān)節(jié)囊,顯露膝關(guān)節(jié),肉眼觀察膝關(guān)節(jié)軟骨退變大體情況,取脛骨內(nèi)側(cè)髁,完整剔除周圍肌肉筋膜等軟組織,置于4%多聚甲醛溶液下,4℃冰箱固定24 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)充分浸洗,沖洗2 h,15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣4 w,修整組織塊,石蠟包埋處理,作冠狀面不連續(xù)切片,每個(gè)標(biāo)本切9張,間隔100 μm切片,各取3張分別行HE,NGF和CGRP免疫組化染色。肉眼觀察大鼠膝關(guān)節(jié)大體情況,顯微鏡下觀察HE染色,并對(duì)軟骨進(jìn)行Mankin評(píng)分,采用ImageProPlus5.0.2圖像分析系統(tǒng)軟件分析CGRP、SP免疫組化染色切片,置于40倍物鏡下取軟骨表層至鈣化層為觀察范圍,每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選3個(gè)視野,測定其灰度值。

        1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

        2 結(jié) 果

        2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況 動(dòng)物術(shù)后均未發(fā)生傷口感染,早期大鼠活動(dòng)減少,跛行,1 w后基本恢復(fù)正?;顒?dòng),未發(fā)生死亡情況。

        2.2HE染色細(xì)胞形態(tài)學(xué) 對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨的層次結(jié)構(gòu)清晰,軟骨表面無破壞,保持其完整性;2 w組關(guān)節(jié)軟骨表層軟骨細(xì)胞發(fā)生改變,可見細(xì)胞聚集現(xiàn)象,于軟骨表層及中間層交界處,可見不規(guī)則軟骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞呈巢狀,排列紊亂,軟骨細(xì)胞大小、密度不均一;4 w組軟骨細(xì)胞數(shù)量變少,排列更加紊亂,可見軟骨表明毛糙;8 w組上述改變更加嚴(yán)重,部分區(qū)域軟骨細(xì)胞缺損(圖1)。2 w組〔(3.82±0.48)分〕,4 w組〔(5.24±0.92)分〕,8 w組Mankin評(píng)分〔(7.14±0.31)分〕明顯高于對(duì)照組〔(0.58±0.53)分〕,表明建模成功,各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=25.3,P<0.01)。

        圖1 各組軟骨細(xì)胞HE染色(×40)

        2.3血清 OPG 結(jié)果 與對(duì)照組(290.7±10.4)相比,2 w組(263.6±8.2)及4 w組血清OPG濃度(178.5±7.5)逐漸下降,8 w組(240.9±6.3)又稍回升,各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=29.3,P<0.01)。

        2.4CGRP、NGF免疫組化染色切片結(jié)果 CGRP、NGF免疫組化染色,兩組變化趨勢相一致,對(duì)照組骨小梁區(qū)周圍著色區(qū)域多,著色較深;2 w組骨小梁著色區(qū)域變淡;4 w組相應(yīng)著色更少,8 w組較前顏色稍加深,見圖2、圖3?;叶戎到Y(jié)果見表1,CGRP各組間比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),NGF各組間比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

        圖2 各組CGRP免疫組化切片(×100)

        圖3 各組NGF免疫組化切片(×100)

        組別CGRPNGF對(duì)照組190.2±8.3110.6±4.52 w組171.2±6.892.6±5.14 w組113.5±8.663.0±7.38 w組145.7±6.977.2±4.8F/P值22.8/<0.0125.8/<0.01

        3 討 論

        OA是最常見的一種關(guān)節(jié)疾病,其發(fā)生是由于各種因素導(dǎo)致生物力學(xué)特性改變,致使關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨及細(xì)胞外基質(zhì)失衡。長期以來,軟骨退變一直是國內(nèi)外比較關(guān)注的重點(diǎn),對(duì)于軟骨下骨的作用研究較少,近些年來發(fā)現(xiàn)軟骨下骨改變是OA的重要病理變化,盡管對(duì)于其是否是OA始發(fā)因素尚存在爭論。許多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證明,OA時(shí)軟骨下骨重塑所導(dǎo)致的骨質(zhì)硬化,骨密度增高,使軟骨下骨的生物學(xué)性能改變,其對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)功能下降,進(jìn)而引起或者加重關(guān)節(jié)軟骨退變〔5〕。

        OPG、RANKL、RANK是目前公認(rèn)的調(diào)控骨代謝的重要途徑,其為腫瘤壞死因子家族成員,通過作用于破骨細(xì)胞,調(diào)控著骨形成及骨吸收。RANK與RANKL結(jié)合后,可通過核因子途徑激活破骨細(xì)胞分化的信號(hào)傳導(dǎo)通路,誘發(fā)相應(yīng)激酶,發(fā)生一系列酶鏈反應(yīng),激活核因子復(fù)合體、活化蛋白-1及轉(zhuǎn)錄因子,核因子再次激活破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的核因子復(fù)合體,通過一系列反應(yīng),使沒有功能的破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化成有活性的破骨細(xì)胞。最近研究發(fā)現(xiàn),OPG/RANK/RANKL不僅在軟骨下骨中表達(dá),發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,軟骨本身也能產(chǎn)生OPG、RANK、RANKL,OPG通過相應(yīng)途徑調(diào)控軟骨代謝,在OA疾病進(jìn)展中發(fā)揮著不可忽略的作用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)〔7〕,通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),OA組和正常組均有上述因子產(chǎn)生,軟骨細(xì)胞OPG的含量較RANK與RANKL高,OA患者RANK含量明顯較正常組增高。OA軟骨產(chǎn)生并分泌OPG,在OA軟骨細(xì)胞表面,也可以發(fā)現(xiàn)RANK及RANKL,有趣的是,盡管膜性RANKL在所有軟骨細(xì)胞均可發(fā)現(xiàn),膜性RANK僅在軟骨細(xì)胞某些亞群產(chǎn)生,僅有(29±4)%的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生RANK,這些軟骨細(xì)胞分布在整個(gè)軟骨層,進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn),表達(dá)RANK的軟骨細(xì)胞其軟骨細(xì)胞標(biāo)志物如蛋白聚糖,膠原酶-Ⅱ含量明顯增高。本實(shí)驗(yàn)通過測量血清OPG含量,從側(cè)面間接反映大鼠OA時(shí)期軟骨代謝的改變,發(fā)現(xiàn)早期OPG含量一直下降,8 w后又稍上升,這些與上述結(jié)果符合,也與文獻(xiàn)報(bào)道的其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似〔8〕,這些均說明OPG在OA疾病進(jìn)展中發(fā)揮著不可忽略的作用。OA早期,骨吸收為主要改變,OPG的抑制破骨細(xì)胞功能下降,破骨細(xì)胞功能加強(qiáng),導(dǎo)致軟骨下骨皮質(zhì)終板及骨小梁稀疏變薄,最終骨小梁失去彈性;后期,OPG含量逐漸增高,促進(jìn)成骨細(xì)胞功能加強(qiáng),關(guān)節(jié)形成骨贅,代償關(guān)節(jié)改變。提示OA軟骨下骨骨代謝不單純是骨吸收過程,其是骨吸收與骨形成共同作用,軟骨下骨較高的骨轉(zhuǎn)化率是其重要的特點(diǎn)。

        正常骨組織代謝離不開神經(jīng)系統(tǒng)有效的調(diào)控,骨組織中含有較多的神經(jīng)分泌的NP類物質(zhì),如CGRP、SP、VIP、NPY等,這些物質(zhì)的受體均在骨組織中表達(dá),許多在體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),這些肽類物質(zhì)調(diào)控著骨的代謝,影響骨細(xì)胞的生物學(xué)功能〔8〕。交感神經(jīng)、感覺神經(jīng)在骨小梁附近血管周圍交織成稠密的網(wǎng)織結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)在骨的形成、生長、轉(zhuǎn)化及修復(fù)過程中具有很關(guān)鍵的作用〔9〕,這些神經(jīng)元細(xì)胞在外周的生長與生存又需要外周信號(hào)的引導(dǎo),在骨組織中承擔(dān)這一角色的是NGF,總而言之,正常骨代謝需要交感神經(jīng)系統(tǒng)、感覺神經(jīng)系統(tǒng)及骨組織內(nèi)相應(yīng)細(xì)胞的共同作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在早期軟骨下骨骨吸收為主,而CGRP對(duì)骨組織主要的生理學(xué)作用為促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨作用,其通過促進(jìn)成骨細(xì)胞環(huán)腺苷酸(c-AMP)形成,提高成骨活性,并刺激成骨細(xì)胞來源細(xì)胞增殖、分化。更深入研究〔10〕發(fā)現(xiàn)CGRP可增加胰島素樣生長因子(IGF)-1 mRNA的表達(dá),使IGF-1合成增加,從而促進(jìn)骨形成。CGRP尚具有抑制破骨細(xì)胞的功能,使骨吸收能力下降,降低血中鈣含量。骨折時(shí),CGRP含量明顯上升,促進(jìn)骨形成,抑制骨吸收,促進(jìn)骨折的愈合。體外研究發(fā)現(xiàn)〔11〕,CGRP可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,進(jìn)而抑制骨吸收,促進(jìn)骨形成。有研究表明〔12〕,CGRP還可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生來促進(jìn)骨的血管化,而血管化又與軟骨下骨骨髓組織纖維化及OA疼痛相關(guān)。軟骨下骨骨髓組織纖維化與NGF的關(guān)系也很密切,其能誘使神經(jīng)纖維長入骨組織中,加重OA疼痛癥狀。NGF能誘使血管及神經(jīng)組織生成,有研究發(fā)現(xiàn)NGF受體可在成骨細(xì)胞上表達(dá),NGF與之結(jié)合后,增強(qiáng)其成骨能力〔13〕。近期研究顯示,NGF在介導(dǎo)OA滑膜血管生成及疼痛方面有重要作用〔14〕,神經(jīng)因子,特別是NGF在OA關(guān)節(jié)滑液及滑膜炎患者滑膜組織中表達(dá),另一實(shí)驗(yàn)證明人類軟骨細(xì)胞能合成NGF并在其表面表達(dá)高親和性NGF受體,在OA病程中,軟骨細(xì)胞NGF及其受體表達(dá)上調(diào),表明NGF在OA病程中能促進(jìn)軟骨細(xì)胞代謝〔15〕。

        綜上,軟骨下骨在OA中的作用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn),通過藥物作用于軟骨下骨,改善其代謝,維持其生物力學(xué)特性,或許是OA藥物治療的一個(gè)新的方向。采用前交叉韌帶切斷方法可成功制造大鼠OA模型,該實(shí)驗(yàn)方法簡單,成功率高;血清OPG、軟骨下骨CGRP、NGF作為調(diào)節(jié)骨代謝因子,調(diào)控著OA軟骨下骨骨代謝,是OA疾病發(fā)生的重要因子;通過藥物調(diào)節(jié)軟骨下骨骨代謝有希望達(dá)到治療OA的目的。

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