陶一鳴 杜艷軍 田青 王靜芝 孫國(guó)杰 沈峰

(1湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，湖北 武漢 430061；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

老年性癡呆是一種隨著年齡增加持續(xù)性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，又稱阿爾茨海默病(AD)，其臨床特征為認(rèn)知能力的損傷、行為與人格的改變。β淀粉樣蛋白(Aβ)代謝障礙及異常沉積是 AD的早期事件，是AD病理過(guò)程的中心因素〔1〕，星形膠質(zhì)細(xì)胞(AC)介導(dǎo)的神經(jīng)炎性病變?cè)诖诉^(guò)程中有著不可忽視的作用。以往的研究多集中在AC在Aβ刺激下大量分泌促炎性因子而加重AD病理進(jìn)程〔2，3〕。本研究探討針灸是否調(diào)控AC促分泌抑炎性因子白細(xì)胞介素(IL)-10而發(fā)揮其保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠(湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心)，月齡為(8±2)個(gè)月，體重為(380±20)g。適應(yīng)性喂養(yǎng)在溫度為(22±2)℃的動(dòng)物室，自然光線，自由飲水，普通飼料(非鋁制品的器皿中存放)。隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和治療組。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守國(guó)家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》相關(guān)規(guī)定。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)；大鼠腦立體定位儀；牙科鉆；微量注射器；華佗牌Φ0.3×25 mm不銹鋼毫針；G6805-Ⅱ型電針治療儀；高速冷凍離心機(jī)；熒光正置顯微鏡(Nikon，Japan)；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)一抗(美國(guó)Abcam公司，ab53554)、IL-10一抗(美國(guó)Abacam公司，ab9969)；Alexa Fluor488綠色-山羊抗兔IgG(美國(guó)Invitrogen公司，A11008)、Alexa Fluor488紅色-山羊抗小鼠IgG(美國(guó)Invitrogen公司，A11001)、10%水合氯醛、4%多聚甲醛等。

1.3動(dòng)物模型的復(fù)制 10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，腦立體定位儀上俯臥固定，保持前后囟同一水平。剪開(kāi)頭皮暴露前囟，按照大鼠腦立體定位圖譜〔4〕定位海馬區(qū)域(前囟后3.3 mm，中線左右各旁開(kāi)1.5 mm，深度3 mm)，微量注射器緩慢注入5 μl聚集肽的 Aβ1～42(制備法：0.1 mg Aβ1～42單體，二甲基亞砜50 μl溶解后，離心，加入50 μl 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液，稀釋配制成1 μg/μl的溶液，37℃水浴箱孵育7 d)，5 min內(nèi)注射完，靜置3 min，緩慢出針(速度1.0 mm/min)，防止藥物溢出，牙托粉封固，縫合皮膚，造模完成。肌注青霉素G10萬(wàn)U，連續(xù)3 d。

1.4干預(yù)方法 治療組于模型復(fù)制成功后，參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》動(dòng)物穴位圖譜選取“百會(huì)”(GV20，頂骨正中)和“腎俞”(BL23，第2腰椎下兩旁)穴〔5〕，采用0.30 mm×25 mm不銹鋼針灸針，百會(huì)向前平刺3～5 mm，腎俞穴稍向內(nèi)斜刺5 mm，接 G6805-Ⅱ型治療儀(雙側(cè)腎俞穴交替選擇)，連續(xù)波，頻率5 Hz，強(qiáng)度以大鼠后爪輕微抖動(dòng)為度。1次/d，每次20 min，每療程連續(xù)6 d，療程間隔1 d，共2個(gè)療程。對(duì)照組與模型組不予電針刺激。假手術(shù)組僅在造模過(guò)程中注射等量生理鹽水，余步驟同模型組。

1.5動(dòng)物取材 大鼠經(jīng)10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定于鼠板，行胸腹聯(lián)合切口，先暴露腹主動(dòng)脈，采血針管取血，離心取上清液。再切斷肋骨、膈肌，心臟暴露時(shí)從左心室插入灌注針頭，并快速灌入無(wú)菌生理鹽水，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，沖洗血液至肝臟發(fā)白。繼改用4%多聚甲醛灌注固定至大鼠軀干四肢僵硬狀。斷頭取腦，視交叉平面后4 mm冠狀切腦，置于4%多聚甲醛外固定24 h。

1.6免疫組化法 常規(guī)石蠟切片脫蠟至水；乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液抗原修復(fù)；37℃，用3%H2O2液孵育25 min，置磷酸鹽緩沖液(PBS)中搖床洗滌3次，5 min/次；吸干，適當(dāng)?shù)稳?%牛血清白蛋白(BSA)均勻覆蓋組織，封閉30 min；一抗4℃孵育過(guò)夜，后置PBS中搖床洗滌3次，5 min/次；吸干，加入二抗，孵育50 min，再置于PBS中搖床洗滌3次，5 min/次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)；蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用顯微鏡采集圖像，每組隨機(jī)選取10張400倍視野下圖片，圖片應(yīng)讓組織填滿整個(gè)視野。應(yīng)用 Image-Pro Plus6.0軟件分析，記錄每張圖片陽(yáng)性累積光密度值(IOD值)和面積(Area)，用 IOD/Area求得平均光密度值(MOD)。數(shù)值越大表示其含量越多，指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)，數(shù)值越小表示陽(yáng)性表達(dá)越弱。

1.7免疫雙標(biāo)法 步驟同免疫組化法，僅二抗滴加異硫氰酸熒光素(FITC)山羊抗兔IgG(綠色熒光)和山羊抗小鼠IgG(紅色熒光)，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。若紅、綠熒光共存的細(xì)胞即GFAP和IL-10表達(dá)在同一細(xì)胞。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組齒狀回區(qū)GFAP表達(dá) 與假手術(shù)組(1.301±0.016)和對(duì)照組(1.246±0.035)相比，模型組(2.593±0.022)和治療組GFAP表達(dá)均顯著升高(2.528±0.018，P<0.01)；但治療組和模型組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。免疫組化圖片也可見(jiàn)，對(duì)照組和假手術(shù)組齒狀回GFAP陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)較少，表現(xiàn)為胞體小，突起細(xì)長(zhǎng)；模型組和治療組AC數(shù)量明顯增多，且胞體大，突起粗，染色深。見(jiàn)圖1。

2.2各組齒狀回區(qū)IL-10表達(dá) 與假手術(shù)組(38.32±3.11)和對(duì)照組(36.34±3.23)相比，模型組IL-10陽(yáng)性表達(dá)顯著降低(20.58±6.282，P<0.01)；和模型組相比，治療組IL-10陽(yáng)性表達(dá)顯著增強(qiáng)(30.71±6.45，P<0.01)。IL-10可染色于神經(jīng)細(xì)胞胞核和胞質(zhì)，在對(duì)照組與假手術(shù)組的海馬齒狀回均可見(jiàn)呈棕褐色的陽(yáng)性表達(dá)，且細(xì)胞核的密度較高，數(shù)目較多，輪廓較清晰。模型組細(xì)胞排列稀疏，陽(yáng)性表達(dá)數(shù)減少；治療組明顯陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞增多，且染色偏濃。見(jiàn)圖1。

2.3各組GFAP與IL-10的共定位 紅色為GFAP熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞，綠色為IL-10熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞。雙標(biāo)結(jié)果顯示，假手術(shù)組齒狀回IL-10與GFAP共定位呈金黃色；模型組GFAP突起增多，IL-10主要定位于神經(jīng)元細(xì)胞核；治療組IL-10表達(dá)顯著增強(qiáng)，不僅表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞核，也表達(dá)在神經(jīng)元纖維。見(jiàn)圖2。

圖2 各組海馬齒狀回GFAP、IL-10免疫雙標(biāo)圖(×400)

3 討 論

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，Aβ主要是由神經(jīng)元產(chǎn)生的，但近期研究表明AC，特別是在激活狀態(tài)下的AC也可以產(chǎn)生Aβ〔6〕，且持續(xù)和廣泛的AC激活是AD早期的一種現(xiàn)象〔7〕。AC是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫吞噬細(xì)胞，是膠質(zhì)細(xì)胞中功能較全面的一類細(xì)胞〔8〕。由于活化 AC是神經(jīng)炎斑塊的基本成分〔9〕，近年來(lái)關(guān)于AC、炎性反應(yīng)與AD間相互關(guān)系的研究日趨增多，多集中在AC活化后如何大量釋放促炎性因子、氧自由基等各種有害因子，加重Aβ神經(jīng)毒性作用和神經(jīng)元損傷。事實(shí)上，AC也具有神經(jīng)保護(hù)作用，如Funato等〔10〕很早證實(shí)在非癡呆老年腦AC內(nèi)，不僅含有Aβ陽(yáng)性小顆粒，且可通過(guò)溶酶體分解Aβ，說(shuō)明正常情況下AC 具有清除Aβ神經(jīng)毒性的作用。

IL-10作為免疫炎性調(diào)節(jié)因子，在維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)和能量代謝平衡、細(xì)胞存活等方面發(fā)揮重要作用〔11〕，IL-10在AD患者血清和腦脊液中的表達(dá)水平與Aβ42、Aβ42/磷酸化(p)-tau呈明顯的負(fù)相關(guān)性〔12,13〕。本研究結(jié)果提示Aβ1～42激活了AC，且降低了抑炎性因子IL-10的表達(dá)，說(shuō)明大鼠海馬損傷部位的AC增生可能是對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的反應(yīng)〔14〕。

本文表明，在AC沒(méi)有激活的狀態(tài)下，IL-10沉積于AC。而AD模型大鼠不僅清晰可見(jiàn)AC腫脹，且IL-10已不再與GFAP共定位，主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞核。經(jīng)電針治療后，IL-10的表達(dá)顯著增強(qiáng)，不僅表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞核，也表達(dá)在神經(jīng)元纖維，促進(jìn)了IL-10對(duì)神經(jīng)元的抗炎與保護(hù)作用。

海馬齒狀回不僅與學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能相關(guān)，且是神經(jīng)發(fā)生的主要部位〔15〕。本研究提示電針對(duì)AD的調(diào)節(jié)作用不限于抗炎作用，很可能與其發(fā)揮類似神經(jīng)干細(xì)胞功能〔16〕、誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞〔17〕、與神經(jīng)元的能量代謝耦聯(lián)作用〔18〕等有關(guān)，其具體機(jī)制有待深入研究。