李 娟 楊 勇 李 朝 魯紅林 肖望成黃翠琴 段 綱 曾邦權(quán) 段博芳 代飛燕*

(1.云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，昆明，650201；2.昆明市瀕危動(dòng)植物收容拯救中心，昆明，651700；3.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖，364000；4.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，昆明，650201)

紅嘴鷗(Chroicocephalusridibundus)是分布于歐亞大陸和北美洲東部沿海的一種候鳥(niǎo)，在歐亞大陸繁殖，到非洲北部、印度、菲律賓和日本一帶越冬。在中國(guó)其繁殖地在新疆、內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林等地，而越冬地卻很廣闊，北起東北地區(qū)的南部，西抵西藏南部，東至臺(tái)灣，沿海各省常見(jiàn)[1-2]。昆明位于我國(guó)西南部，北緯緯度低，處于亞熱帶高原季風(fēng)氣候地區(qū)，同時(shí)受到印度洋西南暖氣流的影響，所以年溫差小，年平均氣溫15℃左右，這樣的一個(gè)環(huán)境便吸引了紅海鷗的到來(lái)，每年11月至次年3月來(lái)云南過(guò)冬，絕大部分棲息在昆明滇池水域，另外昆明翠湖和大觀河、大理洱海等地有零星分布。每年冬天，有紅嘴鷗的地方就是亮麗的風(fēng)景，深受昆明人的喜愛(ài)，也吸引著全國(guó)各地來(lái)觀光的旅客。但是紅嘴鷗在遷徙過(guò)程中，難免會(huì)感染某些傳染性疾病或攜帶著某些病原菌，而這些病原菌是否會(huì)通過(guò)與紅嘴鷗親密接觸后導(dǎo)致人群被感染，又或者是紅嘴鷗的糞便污染了水源然后導(dǎo)致一些細(xì)菌性傳染病暴發(fā)流行，所以針對(duì)紅嘴鷗是否有攜帶病菌的研究尤其重要。本研究對(duì)紅嘴鷗腹瀉糞便進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，以期找到至其腹瀉的病原，為采取保護(hù)措施提供科學(xué)依據(jù)，并為習(xí)慣與紅嘴鷗親密嬉戲的游人提供安全的公共環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品及試驗(yàn)動(dòng)物

采集云南昆明滇池水域紅嘴鷗腹瀉糞便棉拭子10份。

1.1.2 主要儀器

MCV-131BNF無(wú)菌超凈臺(tái)、MLS-3020高壓滅菌器、MOV-212電熱恒溫干燥箱(SANYO/日本)、恒溫培養(yǎng)箱、電子分析天平(上海)。

1.1.3 培養(yǎng)基

根據(jù)禽類腸道正常菌群的特點(diǎn)，選用肉湯培養(yǎng)基、血清普通瓊脂培養(yǎng)基、 LB瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)(EMB)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基等選擇培養(yǎng)基(購(gòu)自上海生工生物試劑有限公司)。

1.2 細(xì)菌分離

在無(wú)菌條件下，將糞便樣本，接種到普通肉湯培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)中，放入37℃搖床培養(yǎng)12 h。吸取菌液1 mL進(jìn)行10倍梯度稀釋，取108稀釋的菌液200 μL，涂布在鮮血瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)上，放入培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24～48 h。挑取肉眼能區(qū)分出的表征各異的菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)上畫線接種，并進(jìn)行純化培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)15～24 h后對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，并記錄菌株的形態(tài)。根據(jù)細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的不同表征及革蘭氏染色結(jié)果，對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行初步分類。計(jì)算每類細(xì)菌的檢出率，即存在某一類細(xì)菌的樣品數(shù)占總樣品數(shù)的百分比。

1.3 生化鑒定

挑取純培養(yǎng)的單菌落到生理鹽水管中，調(diào)節(jié)麥?zhǔn)隙葹?.5，吸取0.5 mL菌液接種于細(xì)菌生理生化鑒定管(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)中，放入培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24～38 h，判定結(jié)果，判定依據(jù)為《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[3]。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

利用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物(上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，分離純化細(xì)菌后，參照細(xì)菌基因組DNA試劑盒(天根生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌總DNA，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物擴(kuò)增16S rDNA基因片段。以新鮮培養(yǎng)的菌液為模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(引物均由上海生工生物科技有限公司合成)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL，預(yù)混DNA聚合酶12.5 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。陽(yáng)性對(duì)照中，模板為實(shí)驗(yàn)室保存的大腸埃希菌(Escherichiacoli)菌株的DNA；陰性對(duì)照中，模板為ddH2O。分別取5 UI PCR產(chǎn)物和DL2000 Marker(大連寶生物工程有限公司)，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)通用型DNA純化回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的條帶。將膠回收產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交到NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列比對(duì)，找到同源性最高的幾個(gè)序列，確定分離細(xì)菌屬，尋找同源性最高的細(xì)菌，下載該屬的序列，用Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。并采用鄰接法(neighbor joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)，將麥?zhǔn)隙葹?.5的菌液均勻涂在普通瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)上，貼上12種藥敏紙片(杭州濱河微生物試劑有限公司)，藥敏紙片上分別含有抗生素氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢拉啶、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環(huán)素、氯霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、磺胺異惡唑、頭孢曲松鈉。將貼有藥敏紙片的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中35°C培養(yǎng)16～18 h后測(cè)量抑菌圈直徑，并依據(jù)紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T125-1999，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部2000)判定結(jié)果。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，若質(zhì)控菌株藥物敏感度正常，則藥敏試驗(yàn)的結(jié)果可靠。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離純化

從10份糞便樣品中共分離出70株細(xì)菌，將分離菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上劃線培養(yǎng)后，根據(jù)其在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的不同表征及革蘭氏染色結(jié)果，對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行初步分類，得到6類細(xì)菌，其在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1(順序依次為1/2/3/4/5/6號(hào)菌)。從6類細(xì)菌中各挑取1株典型細(xì)菌進(jìn)行純化鑒定，革蘭氏染色結(jié)果、在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的培養(yǎng)性狀以及檢出率見(jiàn)表1。

2.2 分離菌的生化鑒定

對(duì)6株細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定，生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。1～6號(hào)細(xì)菌分別為埃希氏(Escherichia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、志賀氏菌屬(Shigella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的生化指標(biāo)一致，故初步判定1～6號(hào)細(xì)菌分別屬于上述6個(gè)屬。

2.3 16S rRNA鑒定結(jié)果

對(duì)6株分離菌的16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增之后，用1.0%瓊脂糖凝膠對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)(圖2)。6個(gè)樣本均得到明亮的電泳條帶，且大小在1 500 bp左右，與預(yù)期大小相符，可用于測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在Genbank中進(jìn)行相似性比對(duì)，并用測(cè)序獲得的16S rRNA序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)，判定出6株分離菌分別為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytosus)，與生化鑒定結(jié)果一致。

圖1 6種分離菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Fig.1 Six isolated strains grown on nutrient agar medium

表1 分離菌的革蘭氏染色結(jié)果、菌落形態(tài)特征及檢出率

Tab.1 Gram dyeing，culture shape and detection rate of isolated bacterial strains

表2 分離菌株生化鑒定結(jié)果

Tab.2 Biochemical identification results of isolated strains

續(xù)表2

注：“+”為陽(yáng)性反應(yīng)，“-”為陰性反應(yīng)

Note：“+”means positive，“-”means negative

2.4 藥敏試驗(yàn)

對(duì)6株分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)顯示，大腸埃希菌對(duì)阿米卡星高敏；金黃色葡萄球菌對(duì)慶大霉素高敏；屎腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素高敏；志賀氏菌對(duì)阿米卡星高敏；粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)環(huán)丙沙星敏感；產(chǎn)酸克雷伯菌對(duì)恩諾沙星敏感。6種分離菌種對(duì)其余抗生素具有不同程度的敏感性(表3)。質(zhì)控菌株藥物敏感度正常。

圖2 16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 16S rRNA phylogenetic tree

表3 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 Antibiotic resistance test of the isolated bacterial strains

注：抑菌圈的直徑≥20 mm為極敏感，15～20 mm為高度敏感，10～14 mm為中度敏感，10 mm以下且>0為低度敏感，等于0則為不敏感

Note：Diaphragm diameter≥20 mm extremely sensitive，15-20 mm highly sensitive，10-14 mm moderately sensitive，diaphragm diameter<10 mm，diaphragm diameter>0，low sensitivity，=0 not sensitive

3 討論

從10份滇池地區(qū)腹瀉紅嘴鷗糞便中分離到70株細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并分類，根據(jù)其生化特性及16S rRNA鑒定結(jié)果，鑒定出6種細(xì)菌。其中大腸埃希菌[4]、志賀氏菌[5-6]、腸球菌[7-8]、粘質(zhì)沙雷氏菌[9]、產(chǎn)酸克雷伯菌[10-11]是重要的條件致病菌。

當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，這些細(xì)菌就會(huì)侵染機(jī)體，引起機(jī)體感染或死亡，對(duì)機(jī)體構(gòu)成嚴(yán)重威脅[7]，大腸桿菌引起腹瀉從已有的流行病學(xué)調(diào)查資料看[4]，我國(guó)也存在散發(fā)病例，主要表現(xiàn)為感染性腹瀉是近幾年新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的食源性疾病。越來(lái)越多的流行顯示其與食用水和蔬菜有關(guān)，而很多的流行情況都是因?yàn)閹Ь鷦?dòng)物的糞便傳播，大腸桿菌能夠長(zhǎng)期存在動(dòng)物體內(nèi)，并且不斷向外界排菌，對(duì)周邊環(huán)境和動(dòng)物的胴體造成污染，嚴(yán)重影響了人類的身體健康，威脅人們的生命。

金黃色葡萄球菌在自然界中分布廣泛，多種禽類都可感染金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌的主要傳播途徑為創(chuàng)傷，也可通過(guò)消化道和呼吸道感染[12]。

志賀氏菌常引發(fā)細(xì)菌性痢疾，通稱為痢疾桿菌，并且其在自然界中分布較為廣泛，是人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腸道致病菌，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌性痢疾，具有高度傳染性，對(duì)人類和動(dòng)物健康造成嚴(yán)重的影響[13]。人類對(duì)志賀氏菌易感。一般說(shuō)來(lái)，志賀氏菌所致菌痢的病情較重；排菌時(shí)間長(zhǎng)，易轉(zhuǎn)為慢性。這樣患病動(dòng)物攜帶致病菌，更容易通過(guò)糞便污染水源，進(jìn)而威脅到人類健康。志賀氏菌能夠在潮濕土壤中生存34 d，37℃水中生存20 d，在糞便內(nèi)(室內(nèi)溫度)生存11 d，滇池水域是昆明最大的流動(dòng)水域，在此水域中存在的志賀氏菌對(duì)昆明市民的健康有極大的威脅。

在自然界環(huán)境中，沙雷氏菌廣泛分布于水和土壤中。而水作為沙雷氏菌的主要生存環(huán)境之一，分離出很多種屬的沙雷氏菌，如普城沙雷菌(Serratiaplymuthica)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、根際沙雷氏菌(Serratiaesseyan)等都分離自水中[10]。有相關(guān)研究報(bào)道指出，對(duì)河水中的沙雷氏菌進(jìn)行分離統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，其中粘質(zhì)沙雷氏菌占75%[14]。沙雷氏菌菌株是脊椎動(dòng)物的機(jī)會(huì)性病原菌，由于很少有關(guān)于沙雷氏菌感染畜禽或野生動(dòng)物的報(bào)道[15]，以致獸醫(yī)界對(duì)于沙雷氏菌的重視遠(yuǎn)不及人醫(yī)，但是仍有個(gè)別案例顯示沙雷氏菌能感染鱷魚(yú)等爬行動(dòng)物，造成皮下膿腫，饋痕等癥狀[15]。同樣有少部分案例顯示，沙雷氏菌能感染哺乳動(dòng)物，造成奶牛乳腺感染[16-17]，以及造成部分牲畜患敗血癥等[18]。

產(chǎn)酸克雷伯菌可導(dǎo)致人畜患病，常引起腹瀉和食物中毒[15-16]。

從滇池地區(qū)腹瀉紅嘴鷗糞便中分離到6種不同的病原性細(xì)菌，極有可能與鳥(niǎo)只腹瀉有關(guān)?？赡苁怯捎诩t嘴鷗在遷徙停歇地接觸受污染的農(nóng)田、垃圾等，導(dǎo)致其攝入含有細(xì)菌的食物，其攜帶的細(xì)菌在機(jī)體免疫力下降時(shí)侵入機(jī)體，而這些菌株也可隨著紅嘴鷗的遷徙，擴(kuò)散到更廣泛的地區(qū)，并對(duì)人類和野生動(dòng)物的健康、魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)等產(chǎn)業(yè)造成潛在的威脅。因此，調(diào)查紅嘴鷗攜帶致病菌和耐藥菌株的情況，對(duì)野生動(dòng)物疫病的監(jiān)測(cè)與防控，以及對(duì)人類健康和野生動(dòng)物的保護(hù)具有重要意義。