蒲文淵 鄭繼平* 曾紀(jì)鋒 楊 諾 郭桂英 王 宇

(1.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院(生物學(xué)院)，?？?，570228；2.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院(動(dòng)物科技學(xué)院)，?？?，570228)

緬甸蟒(Pythonbivittatus)屬于爬行綱(Peptilia)有鱗目(Squamata)蛇亞目(Serpentes)原蛇下目(Henophidia)蟒科(Pythonidae)蟒屬，是潮濕雨林性的典型物種[1]。在東南亞和我國(guó)海南、西南、華南等地均有分布，因?yàn)榫挼轵纳咂?、蛇肉具有很高的?jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，近年來(lái)東南亞和我國(guó)海南地區(qū)人工養(yǎng)殖緬甸蟒逐漸興起[2]。在養(yǎng)殖過(guò)程中，肺炎是一種嚴(yán)重危害緬甸蟒健康的常見疾病，一般是由于季節(jié)交替晝夜溫差大緬甸蟒抵抗力下降病原菌引起肺部感染，最終因轉(zhuǎn)為嚴(yán)重肺炎而導(dǎo)致緬甸蟒呼吸衰竭死亡[3-4]。感染性肺炎對(duì)海南人工養(yǎng)殖緬甸蟒造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

沙門氏菌(Salmonellaspp.)是一類常見的食源性致病菌。其能定居于機(jī)體內(nèi)多個(gè)內(nèi)臟器官，通過(guò)生殖系統(tǒng)和糞便能夠垂直傳播和水平傳播，嚴(yán)重危害人和動(dòng)物的健康。有研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌是引發(fā)緬甸蟒感染肺炎的病原菌中非常重要的一類[5-6]。因此，對(duì)于患有肺炎的緬甸蟒進(jìn)行病原沙門氏菌的分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，在緬甸蟒肺炎的預(yù)防及治療中具有重大意義。

2015年10月在海南文昌緬甸蟒養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)4條發(fā)病蟒蛇，其出現(xiàn)呼吸困難、體表灰暗、無(wú)法蛻皮和體格消瘦的特征。解剖后發(fā)現(xiàn)肺部有大量濃稠炎性滲出物，氣管被痰液堵塞。我們分別從4條緬甸蟒的肺部組織和血液中在無(wú)菌條件下進(jìn)行病原菌的分離，通過(guò)革蘭氏染色、生化特征檢測(cè)和16S rRNA技術(shù)對(duì)所分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。以探究引起此次緬甸蟒感染肺炎的病原菌。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

病料采自海南省文昌緬甸蟒養(yǎng)殖基地的4條因患肺炎而死亡的人工養(yǎng)殖緬甸蟒，其中包括體重為15.2 kg的3歲雌性緬甸蟒(Python1)、體重為16.8 kg的3歲雄性緬甸蟒(Python2)、體重為11.0 kg的2.5歲雄性緬甸蟒(Python3)和體重為19.0 kg的2.5歲雌性緬甸蟒(Python4)。主要病理特征在肺部出現(xiàn)大量濃稠炎性滲出物，通過(guò)無(wú)菌采取心血和肺部組織樣品。

1.2 主要試劑

無(wú)菌脫纖維羊血培養(yǎng)基購(gòu)自上海廣銳生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司；糖、醇類發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基、尿素酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和商品化三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基；細(xì)菌基因組提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、pXT19-T Vector、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；常用藥敏試紙，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離

無(wú)菌采集死亡緬甸蟒的心血和肺部組織分別接種于血瓊脂平板，在恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株。

1.4 細(xì)菌形態(tài)及理化特性鑒定

分別從4條緬甸蟒不同病樣取分離純化后菌株，畫線接種于LB平板中，在37℃培養(yǎng) 24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察其形態(tài)；將純化后的菌株參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]，進(jìn)行糖、醇發(fā)酵、賴氨酸脫羧酶、尿素酶和硫化氫實(shí)驗(yàn)。

1.5 16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

參照基因組提取試劑盒所述方法，提取分離菌株基因組，以其為模板采用細(xì)菌16S rRNA的通用引物F：5′GGGATAACTACTGGAAACGGTA 3′/R：5′GAAGGCACTCCCGTATCTCTA 3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94℃3 min；94℃30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min；PCR產(chǎn)物回收純化后克隆至pXT19-T Vector中，陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序。將分離菌16S rRNA測(cè)序結(jié)果在NCBI據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核酸BLAST比對(duì)，利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行序列同源性分析，通過(guò)Neighbor-Joining方法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 抗菌藥物敏感試驗(yàn)

用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行23種臨床常用抗微生物藥物的藥物敏感性試驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)頒布的抗菌藥物抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 緬甸蟒臨床解剖癥狀

在本研究中4條緬甸的臨床癥狀基本相似，觀察外部特征發(fā)現(xiàn)，蟒蛇精神沉郁、食欲減退、體表暗淡、無(wú)法正常蛻皮和呼吸困難等癥狀。在其口腔內(nèi)出現(xiàn)氣泡裝黏液(圖1：A)。呼吸時(shí)有啰音并有濃痰咳出。剖檢后發(fā)現(xiàn)其呼吸道有乳白色痰液堵塞，在肺臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)濃稠炎性滲出物(圖1：B)，4條發(fā)病蟒蛇的臨床癥狀為典型的感染性肺炎。有研究表明，氣溫驟變對(duì)蟒蛇的健康影響很大，尤其是當(dāng)氣溫降至10℃以下或者溫度變化大于5℃時(shí)極易引起蟒蛇呼吸道疾病[5]，這可能是由于氣溫下降或驟變使蟒蛇免疫力下降導(dǎo)致呼吸道感染進(jìn)而由感冒轉(zhuǎn)變?yōu)榉窝?，最終呼吸衰竭死亡。本次實(shí)驗(yàn)的緬甸蟒發(fā)病時(shí)間均在10月，此時(shí)正值海南秋季多臺(tái)風(fēng)晝夜溫差大，氣候和溫度變化是引起蟒蛇肺炎的重要環(huán)境因素。

A：口腔內(nèi)含有泡沫狀黏液(箭頭所示)A：There is foam mucus in the mouth(shown by arrow)

B：肺部充滿乳白色濃稠炎性滲出物(箭頭所示)B：The lungs are filled with milky white thick inflammatory exudates(shown by arrows)圖1 緬甸蟒病理檢查Fig.1 Pathological examination of python bivittatus

2.2 沙門氏菌的分離與鑒定

將患病緬甸蟒分別進(jìn)行病理剖檢，取肺組織和心血在血瓊脂平板劃線培養(yǎng)，均長(zhǎng)出形態(tài)單一菌落，在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)、中央隆起、半透明、灰白色；革蘭氏染色顯示分離菌均為革蘭陰性，菌體短小，多為單個(gè)排列，無(wú)芽孢、無(wú)莢膜桿。通過(guò)分離純化我們分別從4條患病蟒蛇體內(nèi)各取1株為代表，分別命名為P1、P2、P3和P4。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》方法[8]，對(duì)代表株進(jìn)行糖醇發(fā)酵試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)等生化檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表1)：發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和山梨醇產(chǎn)氣，不發(fā)酵蔗糖和乳糖同時(shí)不水解尿素，4代表株均與腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)生化特征相符。

表1 緬甸蟒分離菌株生化特征

Tab.1 Biochemical characteristics of strains isolated frompython bivittatus

注：“+”陽(yáng)性；“-”陰性

Note：“+”represents positive，“-” represents negative

對(duì)所分離株的16S rRNA基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得的片段為1 500 bp，與預(yù)期大小一致(圖2)。測(cè)序后在NCBI中使用BLAST，對(duì)4株菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行分析。比對(duì)結(jié)果顯示：全部分離株與NR_044371.1Salmonellaentericasubsp.houtenaeDSM 9 221菌株同源性達(dá)到99%。因此，結(jié)合菌株的表型特征、生理生化特性鑒定與16S rRNA序列分析，可以認(rèn)定4代表菌株為腸道沙門氏菌。

圖2 16S rRNA基因PCR電泳圖M：5 000 Marker；1.P1；2.P2；3.P3；4.P4Fig.2 Electrophoresis of 16S rRNA genes PCR amplified products

爬行動(dòng)物是沙門氏菌的重要宿主，其中蛇類沙門氏菌的攜帶率較高，可能會(huì)對(duì)養(yǎng)殖者的健康構(gòu)成威脅[9]。沙門氏菌包括兩個(gè)種分別為S.enterica和S.bongori其中S.enterica又被分為6個(gè)亞種包括：enterica(formersubgeneraⅠ)，salamae(Ⅱ)，arizonae(Ⅲa)，diarizonae(Ⅲb)，houtenae(Ⅳ)和indica(Ⅵ)[8]。有研究報(bào)道，S.subspeciesenterica亞種主要宿主為恒溫動(dòng)物，其他亞種均主要發(fā)現(xiàn)于變溫動(dòng)物[10-11]。而且其中除了S.subspeciesindica亞種外，其他亞種均會(huì)感染人[10]。本次研究所分離的4株緬甸蟒腸道沙門氏菌均為houtenae(Ⅳ)亞種。爬行動(dòng)物所攜帶的S.subspecieshoutenae亞種與兒童的感染有關(guān)，會(huì)引起兒童的腦膜炎[12]。研究發(fā)現(xiàn)，爬行動(dòng)物所攜帶的沙門氏菌與其食物的來(lái)源有關(guān)[12]。海南文昌緬甸蟒養(yǎng)殖場(chǎng)的蟒蛇主要食物為雞，禽類作為一種極易感染沙門氏菌的動(dòng)物很有可能是導(dǎo)致緬甸感染沙門氏菌的主要原因[13]。因此，在緬甸蟒的管理和養(yǎng)殖過(guò)程中，我們應(yīng)該對(duì)其食物來(lái)源進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于養(yǎng)殖人員應(yīng)該做好相應(yīng)的消毒防疫工作，避免感染沙門氏菌對(duì)身體健康造成危害。

2.3 沙門氏菌藥敏實(shí)驗(yàn)分析

緬甸蟒沙門氏菌的防治還主要依靠抗菌藥物，23種抗菌藥物的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示(表2)，4株沙門氏菌分離株對(duì)鏈霉素、頭孢唑啉和磺胺異惡唑部分耐藥；對(duì)氟羅沙星、復(fù)方新諾明和氧氟沙星等12種抗生素完全敏感，但其中卡那霉素、慶大霉素、頭孢哌酮和妥布霉素抗菌藥物在臨床上對(duì)沙門氏菌無(wú)效。其耐藥譜與報(bào)道的沙門氏菌藥物敏感性基本相似[14]，但有的研究中發(fā)現(xiàn)沙門氏菌對(duì)萘啶酸的耐藥性較高[15]。而本次實(shí)驗(yàn)中緬甸蟒沙門氏菌對(duì)萘啶酸敏感。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能與養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的使用有關(guān)，在目前蟒蛇的養(yǎng)殖過(guò)程中一般不會(huì)使用抗生素，因此蟒蛇源沙門氏菌的耐藥情況較少。體外藥敏試驗(yàn)的結(jié)果可為緬甸蟒感染性肺炎防治提供一定指導(dǎo)依據(jù)，但由于蟒蛇飼喂的特點(diǎn)，藥物的定時(shí)定量投給較為困難，抗菌藥物的治療效果并不理想，因此，加強(qiáng)對(duì)蟒蛇的飼養(yǎng)管理，依據(jù)實(shí)際情況對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境溫度適當(dāng)調(diào)控，并對(duì)籠舍進(jìn)行適當(dāng)?shù)膿Q水及消毒，預(yù)防為主，治療為輔，降低緬甸蟒的發(fā)病率，這對(duì)緬甸蟒養(yǎng)殖業(yè)的健康養(yǎng)殖甚為重要。

表2 緬甸蟒分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Drug susceptibility test results of the isolates Python bivittatus

續(xù)表2

注：R：耐藥；I：中度敏感；S：敏感；*：表示敏感性對(duì)應(yīng)抗菌藥物在臨床上對(duì)沙門氏菌無(wú)效

Note：R：Resistance.I：Middle sensitive.S：Sensitivity.*：To indicate that the susceptibility to antimicrobial agents is not clinically effective againstSalmonella

3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)從肺炎緬甸蟒體內(nèi)分離病原菌，通過(guò)細(xì)菌的形態(tài)特征、生化特性和16S rRNA基因鑒定，確定了所分離病原菌均為腸道沙門氏菌。與此同時(shí)，我們對(duì)此次分離的病原菌做了23中抗菌藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到了氟羅沙星等13種藥物對(duì)其敏感。本工作結(jié)果對(duì)海南緬甸蟒養(yǎng)殖過(guò)程中感染肺炎病因?qū)W研究及抗生素防治具有重要價(jià)值。