唐婷婷

[摘要] 目的 通過體外實(shí)驗(yàn)研究成纖維細(xì)胞激活蛋白（Fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法 體外培養(yǎng)人類卵巢癌細(xì)胞系0VCAR3，用不同濃度的FAP（0、0.0625、0.125、0.25、0.5及1 μg/mL）處理24 h或48 h后，通過MTT法檢測FAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。0VCAR3用不同濃度的FAP（0、0.0625、0.25及1 μg/mL）處理48 h后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測FAP 對(duì)OVCAR3細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果 MTT法示FAP可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞OVCAR3增殖，其作用呈時(shí)間、劑量依賴性（P<0.05）;流式細(xì)胞術(shù)示FAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3的細(xì)胞凋亡率并無明顯影響（P>0.05）。 結(jié)論 FAP可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3的增殖，對(duì)其凋亡水平無明顯影響。

[關(guān)鍵詞] 成纖維細(xì)胞激活蛋白;卵巢癌細(xì)胞OVCAR3;增殖;凋亡

[中圖分類號(hào)] R737.31? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）36-0034-03

Effect of fibroblast activation protein on proliferation and apoptosis of ovarian cancer cell

TANG Tingting

Department of Gynecology and Obstetrics， the Fourth People's Hospital of Shenyang City， Shenyang? ?110031， China

[Abstract] Objective To explore the effect of FAP on proliferation and apoptosis of ovarian cancer cell through in vitro experiment. Methods Human ovarian cancer cell line OVCAR3 was cultured in vitro and treated with FAP at different concentrations （0， 0.0625， 0.125， 0.25， 0.5 and 1 μg/mL） for 24 or 48 hours. The effect of FAP on ovarian cancer cell proliferation was detected by MTT assay after treatment. After OVCAR3 was treated with FAP at different concentrations （0， 0.0625， 0.25 and 1 μg/mL） for 48 hours， the effect of FAP on OVCAR3 apoptosis was detected by flow cytometry. Results It was shown by the MTT assay that FAP could promote OVCAR3 proliferation in a time-and dose-dependent manner （P<0.05）. It was shown by the flow cytometry that FAP had no significant effect on the apoptosis rate of ovarian cancer cell line OVCAR3 （P>0.05）. Conclusion FAP can promote the proliferation of ovarian cancer cell line OVCAR3 but has no significant effect on its apoptosis level.

[Key words] Fibroblast activation protein; Ovarian cancer cell OVCAR3; Proliferation; Apoptosis

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一，卵巢惡性上皮性腫瘤的死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位，并已成為嚴(yán)重威脅婦女生命和健康的主要腫瘤[1]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤不僅由癌基因和抑癌基因來調(diào)控，還依賴于由間質(zhì)形成的微環(huán)境的作用[2]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblast，CAF）是腫瘤間質(zhì)的主要成分，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著關(guān)鍵作用。作為CAF的特異性標(biāo)志物的成纖維細(xì)胞激活蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP，又稱Seprase）是一種膜結(jié)合糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶家族，能專一性水解多肽巾脯氨酸殘基的氨基端肽鍵，具有二肽基肽酶和膠原酶的活性[3]。FAP已被證實(shí)主要在上皮性腫瘤的基質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)，它的存在可促進(jìn)腫瘤微血管的形成，對(duì)腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及逆轉(zhuǎn)具有重要意義[4]。

本研究通過體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3，體外給予不同濃度的FAP處理，通過MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測FPA對(duì)卵巢癌細(xì)胞系增殖凋亡的影響，旨在探討FPA與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞株由中國醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng)。用10%胎牛血清（BoMei公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）培養(yǎng)，四甲基偶氮唑鹽（MTT）（凱基），二甲基亞楓（DMSO）（凱基），重組FAP蛋白（SB公司），細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（凱基公司），其余試劑均為東北制藥集團(tuán)公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)? 人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞株由中國醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)：將OVCAR3細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，每48小時(shí)換液1次，當(dāng)細(xì)胞長滿瓶壁的80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化，按1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT比色法測增殖實(shí)驗(yàn)? 將OVCAR3細(xì)胞（3.0×104/mL）接種于96孔板中，用含5% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。每個(gè)96孔板均分為6組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔;24 h后，每板上的6組分別加入無血清培養(yǎng)基（N）、FAP蛋白（1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL，各濃度4個(gè)復(fù)孔）處理;于0、24、48 h各取出一塊96孔板，加入新鮮配制的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心吸棄上清液，每孔加入二甲基亞砜，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶。以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)測定儀檢測490 nm波長下的光吸收值（OD值）。

1.2.3流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期? 將OVCAR3細(xì)胞（1.0×104/mL）接種于6孔板，共9組;24 h后分別加入等量的無胎牛血清培養(yǎng)基，F(xiàn)AP蛋白（0.5、0.375、0.25、0.1875、0.125、0.09375、0.0625、0.04687 μg/mL），每組2個(gè)復(fù)孔;繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，消化孔板中的OVCAR3細(xì)胞，將等量的細(xì)胞懸液與PI染液混合，4℃放置30 min，流式細(xì)胞儀488 nm激發(fā)波長測定細(xì)胞周期。Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，采用SNK法進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAP可影響OVCAR3細(xì)胞的增殖

在OVCAR3細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度FAP（0、0.0625、0.125、0.25、0.5及1 μg/mL）處理24 h或48 h，MTT法檢測FAP 對(duì)OVCAR3細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)AP處理24 h后，各濃度細(xì)胞增殖能力均明顯升高。FAP處理48 h后，各濃度細(xì)胞增殖能力進(jìn)一步顯著增加。體外加入不同濃度FAP，對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3均具有明顯的促增殖作用，并呈現(xiàn)出劑量依賴性（圖1）;且FAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3的促增殖作用隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)（圖2）。

2.2 FAP對(duì)OVCAR3細(xì)胞凋亡的影響

在OVCAR3細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度FAP（0、0.0625、0.25及1 μg/mL）處理48 h后，流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染檢測FAP對(duì)OVCAR3細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示對(duì)照組（FAP 0 μg/mL）OVCAR3細(xì)胞凋亡率為（8.35±0.44）%。不同濃度FAP（0.0625、0.25及1 μg/mL）處理48 h后，OVCAR3細(xì)胞凋亡率并無明顯改變，分別為（8.85±0.73）%、（8.25±1.12）%及（10.00±1.58）%（圖3）。

圖3? ?不同濃度FAP處理后OVCAR3細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第3位。在各類婦科腫瘤中，卵巢上皮癌的死亡率居于首位，對(duì)女性生命造成嚴(yán)重威脅，其中以上皮癌最多見[5-6]。卵巢上皮癌患者手術(shù)中發(fā)現(xiàn)腫瘤局限于卵巢的僅占30%，大多已擴(kuò)散到子宮、雙側(cè)附件、大網(wǎng)膜及盆腔各器官[7]。卵巢癌的發(fā)病病因并不明確，這就導(dǎo)致難以早期做出正確診斷，沒有一級(jí)預(yù)防措施。目前，現(xiàn)有研究表明卵巢癌的發(fā)生可能與以下幾個(gè)方面有關(guān)：癌癥發(fā)病外部因素（包括化學(xué)、物理、生物等致癌因子）、癌癥發(fā)病內(nèi)部因素（包括免疫功能、內(nèi)分泌、遺傳、精神因素等）及飲食營養(yǎng)失調(diào)和不良生活習(xí)慣等[8-10]。

成纖維細(xì)胞活化蛋白FAP存在于腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞中，在細(xì)胞表面發(fā)揮作用，是一種膜絲氨酸肽酶，是Ⅱ型絲氨酸蛋白酶家族成員之一，具有二肽基肽酶及膠原酶活性，在腫瘤的生長中具有雙重功能[11-12]。FAP的蛋白水解酶活性可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲力，同樣也能促進(jìn)腫瘤的生長和增殖。故以FAP作為靶點(diǎn)的分子成像及作為腫瘤基質(zhì)標(biāo)志物的病理診斷、腫瘤基因治療或免疫治療將成為可能。FAP表達(dá)于90%以上的上皮性腫瘤的基質(zhì)成纖維細(xì)胞的胞膜和胞漿中，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌。FAP陽性細(xì)胞靠近腫瘤毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞并圍繞著腫瘤結(jié)節(jié)，但在正常成人的組織、良性和癌前病變的上皮性損傷中通常不表達(dá)[13-15]。

本研究首先應(yīng)用MTT法檢測FAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。在人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3培養(yǎng)基中加入不同濃度的FAP處理24 h或48 h后，OVCAR3細(xì)胞的增殖能力明顯提高，且隨時(shí)間推移逐漸增加。表明不同濃度FAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3均具有明顯的促增殖作用，并呈現(xiàn)出劑量依賴性，且FAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3的促增殖作用隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)。其次，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染法檢測FAP 對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，用不同濃度FAP（0、0.0625、0.25及1 μg/mL）處理OVCAR3細(xì)胞48 h后，各組OVCAR3細(xì)胞凋亡率略有差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即FAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3的細(xì)胞凋亡率并無明顯影響。

本研究表明，體外給予FAP可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3的增殖且有時(shí)間和劑量依賴性。FAP并未顯著影響卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3的凋亡水平。

綜上所述，F(xiàn)AP在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，對(duì)它們的深入研究將有助于闡明卵巢癌的發(fā)病機(jī)制、協(xié)助臨床診斷和評(píng)估病情，同時(shí)為卵巢癌的綜合治療提供更有益的幫助。

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（收稿日期：2019-08-08）