張學(xué)師 ，張紀(jì)兵 ，袁圣 ，薛暉 ，趙彥華

（1.射陽(yáng)縣水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，江蘇 射陽(yáng) 224300；2.南京智億生物技術(shù)有限公司，江蘇 南京 211100；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；4.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus）是一類以裂解其他敏感革蘭氏陰性菌為主的小型寄生性細(xì)菌，其生活周期較獨(dú)特，能夠識(shí)別、侵入并定居宿主菌周質(zhì)空間中，利用宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行絲狀生長(zhǎng)，并裂解宿主細(xì)胞釋放子代蛭弧菌細(xì)胞，造成宿主細(xì)胞死亡[1]。蛭弧菌最早于1962年由Stolp等人首次發(fā)現(xiàn)，屬于原核生物界唯一一類周質(zhì)性專性捕食性細(xì)菌[2]。研究表明，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，蛭弧菌具有能夠防治病害菌的潛力[3]，具有替代抗生素殺滅病害菌的應(yīng)用價(jià)值[4]，且無法侵染真核細(xì)胞，對(duì)生物體無毒副作用[5]。鑒于蛭弧菌裂解宿主細(xì)胞的特性，加工成微生態(tài)制劑，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)學(xué)等不同領(lǐng)域均顯示出廣闊的應(yīng)用前景[6-7]。蛭弧菌的分離計(jì)數(shù)，與噬菌體相似，需要敏感宿主細(xì)菌，供其裂解以生長(zhǎng)繁殖[8]。通常采用含0.1%聚蛋白胨的雙層瓊脂培養(yǎng)基[9]和自來水雙層瓊脂培養(yǎng)基[10]進(jìn)行噬菌斑計(jì)數(shù)。

夏季高溫季節(jié)，細(xì)菌性病害嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，造成較高的發(fā)病率和病死率，針對(duì)蛭弧菌能夠裂解細(xì)菌，替代抗生素的特性，于2018年5月在異育銀鯽養(yǎng)殖試驗(yàn)塘內(nèi)添加含蛭弧菌微生態(tài)制劑，通過細(xì)菌計(jì)數(shù)及細(xì)菌性病害的發(fā)病率和病死率來研究蛭弧菌對(duì)異育銀鯽養(yǎng)殖塘的生物防治作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)塘

射陽(yáng)縣發(fā)陽(yáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖公司1號(hào)及2號(hào)養(yǎng)殖塘，池塘面積約6 000 m2，均為長(zhǎng)方形土池塘，水深1.2～1.5 m，設(shè)1號(hào)為試驗(yàn)塘，2號(hào)為對(duì)照塘，塘內(nèi)所養(yǎng)異育銀鯽為同一時(shí)間放養(yǎng)，且數(shù)量及規(guī)格一致。

1.2 培養(yǎng)基

LB營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉購(gòu)自廣州環(huán)凱生物制品有限公司，3M細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)片購(gòu)自南京某公司，自來水雙層瓊脂培養(yǎng)基（自配）：下層為1.5%自來水瓊脂，上層為0.6%自來水瓊脂。

1.3 菌株

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物保存中心，蛭弧菌微生態(tài)制劑（菌普康）為南京某公司生產(chǎn)。

1.4 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定

分別采集試驗(yàn)塘和對(duì)照塘內(nèi)水樣，進(jìn)行倍比稀釋后，吸取1 mL加入3M細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)片中，30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.5 蛭弧菌總數(shù)測(cè)定

1.5.1 蛭弧菌微生態(tài)制劑的使用 按照蛭弧菌微生態(tài)制劑使用說明書，用滅菌純凈水溶解蛭弧菌凍干粉，于5月初在1號(hào)塘進(jìn)行全塘潑灑，對(duì)照塘潑灑同等體積滅菌純凈水。

1.5.2 宿主菌懸液制備 將大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃溫箱振蕩培養(yǎng)8 h，培養(yǎng)液經(jīng)離心去上清，加入滅菌生理鹽水混勻備用。

1.5.3 蛭弧菌計(jì)數(shù) 將宿主懸液吸取1 mL加入6 mL上層瓊脂試管中迅速搖勻，分別加入采集的試驗(yàn)塘及對(duì)照塘水樣0.1 mL，混勻后倒入已配好的下層瓊脂上，待培養(yǎng)基凝固，倒置30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待噬菌斑形成后計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)菌性病害發(fā)病率統(tǒng)計(jì)

6—9月高溫季節(jié)，每天早中晚3次巡查試驗(yàn)塘及對(duì)照塘，每周隨機(jī)拉網(wǎng)捕撈30～40尾，觀察體表狀態(tài)，根據(jù)癥狀判斷是否為細(xì)菌性疾病，分別計(jì)算試驗(yàn)塘及對(duì)照塘細(xì)菌性疾病發(fā)病率。

2 結(jié)果

2.1 蛭弧菌及細(xì)菌總數(shù)

潑灑前通過池塘互通換水，控制試驗(yàn)塘和對(duì)照塘細(xì)菌總數(shù)均為5.4×106CFU/mL，蛭弧菌濃度均為1.6×102PFU/mL；試驗(yàn)結(jié)束后試驗(yàn)塘蛭弧菌濃度上升為 8.2×105PFU/mL，細(xì)菌總數(shù)下降為 3.7×105CFU/mL，對(duì)照塘細(xì)菌總數(shù)和蛭弧菌濃度均略上升，具體結(jié)果如表1所示。

2.2 細(xì)菌病害發(fā)病率統(tǒng)計(jì)

通過6—9月高溫季節(jié)，異育銀鯽細(xì)菌性病害發(fā)病率統(tǒng)計(jì)，1號(hào)試驗(yàn)塘細(xì)菌性病害發(fā)病率明顯低于2號(hào)對(duì)照塘，如圖1所示。

3 小結(jié)與討論

通過試驗(yàn)塘及對(duì)照塘數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，添加蛭弧菌的試驗(yàn)塘，經(jīng)過30 d試驗(yàn)周期，蛭弧菌數(shù)量顯著增加，細(xì)菌總數(shù)大幅下降，而對(duì)照塘，蛭弧菌數(shù)量和細(xì)菌總數(shù)保持微增長(zhǎng)，分析可能是氣溫升高，水溫上升，細(xì)菌及蛭弧菌繁殖加快所致。后期數(shù)據(jù)采集結(jié)果顯示，添加蛭弧菌的試驗(yàn)塘，細(xì)菌性疾病發(fā)病率明顯低于對(duì)照塘，結(jié)合前期細(xì)菌總數(shù)，表明蛭弧菌對(duì)異育銀鯽養(yǎng)殖池塘具有較好的殺菌效果，可降低細(xì)菌性疾病的發(fā)生。

表1 試驗(yàn)周期蛭弧菌及細(xì)菌總數(shù)變化

圖1 試驗(yàn)塘與對(duì)照塘6—9月發(fā)病率統(tǒng)計(jì)

蛭弧菌作為寄生性細(xì)菌，不僅僅能夠裂解宿主細(xì)胞，同時(shí)還能夠有效地降低養(yǎng)殖水體中氨氮等有害物質(zhì)含量[11]。因此，自1994年國(guó)家批準(zhǔn)蛭弧菌在動(dòng)物養(yǎng)殖上使用以來，蛭弧菌在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛[12]。目前，我國(guó)對(duì)蛭弧菌的研究可分為凈化水質(zhì)，殺滅細(xì)菌及促進(jìn)動(dòng)物體非特異性免疫這3大類。但是蛭弧菌的研究仍然處于初步階段，關(guān)于蛭弧菌在殺滅細(xì)菌的同時(shí)，是否會(huì)破壞養(yǎng)殖水體的微生物種群以及養(yǎng)殖動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)等都仍然是未知問題，建立安全并且完善的蛭弧菌制劑使用程序，才能夠更好的發(fā)揮蛭弧菌的作用，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。